ATP发光检测试剂盒
(ATP-Lite Assay Kit)
产品说明:
ATP,是生命体最基本的能量分子,一种通用的能量“货币”。ATP参与多种酶促反应,维持正常的生命活动。通过ATP检测,可以间接定量测定细菌、细胞的数量和活性状态,了解体外ATP参与的酶促反应的进程,在生物检定和生命科学研究中有广泛的应用。本试剂盒采用生物发光(bioluminescent)法,依据荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化,高效利用ATP的能量,发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)催化的发光反应,与ATP浓度具有很好的线性依赖关系和极高的敏感性,ATP的检测灵敏度达到10-13 mol。本试剂盒采用优化的酶反应体系,使发光反应持续数十分钟,以便于手工操作多个样品。操作简便,可快速获得结果。
产品内容与储存方法:
名称 | 数量 | 保存条件 |
100x Lysis Buffer (细胞裂解液) | 1 ml | -20℃ |
ATP Assay Buffer (反应缓冲液) | 10 ml | -20℃ |
Luciferin | 0.5 ml | -20℃ |
Firefly luciferase | 1 ml | -20℃ |
ATP (1 mM) | 0.5 ml | -20℃ |
可作200次以上ATP检测。低温运输,-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。
所需其它试剂:使用者需准备PBS 、双蒸水等。
操作方法:
样品准备:
对于细胞或微生物样品,应首先提取ATP。本试剂盒提供培养哺乳细胞的ATP提取方法如下。其它标本来源的ATP提取,一般可用三氯乙酸的提取方法,或参照文献一些有效提取方法进行。对体外酶促反应样品,一般可直接用双蒸水稀释后进行检测。样品中ATP含量应稀释到0.1 mM一下,以保证在测定的线性范围内。
培养哺乳细胞样品准备:
1) 配制裂解液:临用前,取适量100x Lysis Buffer (ULB),用双蒸水稀释至1xLB,混匀。1xLB可长期冻存于-20℃。
2) 细胞清洗:倾去培养板/皿中的培养液,加入足量PBS,轻轻洗涤细胞。完全倾去洗涤液。
3) 细胞裂解:在孔/皿中加入足量1xLB,混匀。培养板可在微型振荡器上震荡5~10 min;培养皿可直接用细胞刮刀刮下细胞,将细胞悬液移入1.5 ml离心管,在涡旋振荡器上充分混悬震荡30秒。裂解细胞悬液可直接用于发光测定,也可离心30秒,取上清做发光测定。裂解细胞含量较多时,可将样品用双蒸水稀释,以保证在测定ATP的线性范围内。
配制发光反应液:
测定前,在室温待ATP Assay Buffer和Luciferin溶化,混匀(注意避光)。按20/1比例用ATP assay Buffer稀释Luciferin,再加入1/10体积的Luciferase,配制所需体积的Assay Reagent(注意避光),置冰上待用。
配制ATP标准液:
测定前,在室温待ATP溶化,用双蒸水或1xLB稀释成一定浓度梯度的溶液。该浓度梯度应在0.1 nM~0.1 mM的浓度范围内的一定区间,并涵盖样品ATP浓度的测定范围。
测定仪器的设置:
按仪器操作说明开启发光测定仪。手动操作型仪器,将测读时间设为10-20秒。自动操作型仪器,一般将测定延迟设为2秒,将测读时间设为10-20秒,Assay Reagent的注入体积设定为50 μl。
手动发光测定:
取待测样品5 μl加入测量管底部,取Assay Reagent 50 μl加入管底部,轻轻敲击管壁3~5次混匀,放入仪器中立即测定,记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)。如用多孔板同时手动测定多个样品,则将各待测样品5 μl分别加入连续的各孔底部,用多道加样器于各孔底加入Assay Reagent 50 μl,轻轻敲击板侧3~5次混匀,放入仪器中立即测定,记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)。
自动发光测定:
配制好的Assay Reagent置于测定仪内并连接好对应管道。各待测样品5 μl分别加入测定管/板孔底部,启动自动测量程序。记录Firefly luciferase的发光单位(RLU)。
注意事项:
1) Assay Buffer,Luciferin和Luciferase应避免反复冻熔,可分装成合适体积分次使用。配制好的Aassay Reagent不能长期保存。
2) Luciferase活性可被多种物质如一些去污剂抑制,设计和分析实验结果时,应考虑到这个因素。
3) 测定样品量可设定为2~20 μl;Assay Reagent加入量也可增加至100 μl。但应保持整个实验的一致性。
4) 用多孔板同时手动测定多个样品时,要尽量缩短样品间试剂加入的时间间隔。
5) ATP检测的灵敏度与样品处理方法、发光测定仪器的灵敏度等均有关系。可先进行一个简单的预实验以确定设计实验的灵敏度和ATP检测的线性范围。
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