支原体检测试剂盒

货号: 3020000
Immu-Mark Myco-Test Kit

1          用途

本试剂盒应用直接免疫荧光法测定细胞培养基中的支原体。

2          摘要

在使用细胞培养进行的生物学研究中，连续细胞系的支原体污染是一个主要问题。支原体对培养的细胞产生多种影响（如代谢变化，免疫或生化特性，生长，存活率等）。由于细胞培养中的支原体感染通常是一种慢性感染，可能并不明显的通过肉眼、光镜或常规的检测很难发现，所以定期检查细胞培养中的支原体是很重的。现今已经开发出多种检测细胞培养中的支原体方法(例如DNA荧光染色，监测有毒代谢产物，培养法等)，但每种方法都具有某些缺点。这些方法的主要缺点都是非特异性以及检测耗时长。

本试剂盒中包含了对广泛的支原体物种具有特异性的单克隆抗体，包括Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. fermentans and M. salivarium，包含96％以上细胞培养感染1，2。本方法结合单克隆抗体检测的特异性以及非常短的检测时间——并使用试剂盒中提供的荧光标记二抗——是一种非常敏感的支原体检测方法

3          检测原理

本试剂盒提供两种支原体检测方法：直接法：使用荧光标记的单克隆抗体进行一步法快速筛选疑似阳性样本；间接法：使用标记的单克隆抗体和荧光标记二抗进行极为敏感的支原体检测。标本与一或两种标记的抗体一起孵育20分钟，过量的实际用磷酸盐缓冲液洗去。使用荧光显微镜镜检，如果支原体存在，复染色的红色细胞上或细胞间可看到黄绿色荧光。

4          提供试剂

每个试剂盒包含测试50份细胞样本的足量实际，试剂均为即用型

4.1 试剂

Ÿ           一瓶含有2ml FLUOSO 标记的单克隆抗体，溶于含偶淡蓝(Evans blue)的蛋白稳定缓冲液中。

Ÿ           一瓶含有2ml FITC标记的羊抗小鼠IgG，溶于含偶淡蓝(Evans blue)的蛋白稳定缓冲液中。

以上试剂含有0.1% (w/v)叠氮钠，2-8℃避光保存，不可冷冻

4.2 封片剂

• 一瓶2.5ml的封片剂。 光漂白抑制剂溶于甘油，2-8℃保存。

4.3 质控玻片(货号3020100)

试剂盒中含有阴性和阳性质控玻片各一片，2-8℃保存

5          注意事项

本试剂盒含有0.1% (w/v)的具有毒性的叠氮钠。叠氮钠可与水管的铜或铅反应生成具有爆炸性的金属叠化物。处理含有叠氮钠的试剂时请用大量水冲洗。

试剂中含有偶淡蓝染料。该燃料是一种潜在的致癌物，应避免接触皮肤。

封片剂可能或刺激皮肤，使用时应采取适当的防护措施。勿在操作区域内饮食、抽烟、储放食物。不要使用嘴吸取试剂。

6          样本采集和准备

样本的采集和准备是培养基中支原体检测的首要重点。使用免疫荧光法之后至少2天内不能继代培养，勿加入会影响支原体生长的培养基成分(如类似于庆大霉素或卡那霉素等的抗生素)。样本中必须含有细胞，纯培养基不应测定。 
贴壁细胞可以刮出或使用胰蛋白酶消化。细胞悬浮后将胰蛋白酶洗去。
从液氮储存解冻后的细胞可以直接用于免疫荧光测定，但需先洗去防冻剂。

如果细胞培养液中的细胞接近20,000个，因为必须在同一区域染色，这些细胞培养基可能需要离心浓缩(约 500 x g，5至10分钟)。

玻片准备

取含有20-30ul含有约20,000个细胞的样本于镀膜显微玻片上，形成6-10mm直径的圆形区域，50干燥45分钟，使用-20预冷的乙醇固定60秒，固定后室温干燥。

7          检测步骤

7.1 一步染色法

1.       在固定后的细胞样本上加入一滴FLUOS-标记的单克隆抗体 (试剂1)，确定试剂覆盖了整个样本区域，室温孵育20分钟。不要让样本上的试剂变干，否则会造成非特异性染色。

2.       仔细使用磷酸盐缓冲液冲洗玻片，洗2次，总时间2分钟。

3.       室温干燥

4.       在玻片中心样本区域滴上一滴封片剂(试剂3)，盖上盖玻片，同时避免产生气泡。

7.2 二步染色法

1.       在固定后的细胞样本上加入一滴FLUOS-标记的单克隆抗体 (试剂1)，确定试剂覆盖了整个样本区域，室温孵育20分钟。不要让样本上的试剂变干，否则会造成非特异性染色。

2.       使用磷酸盐缓冲液清洗玻片2次，总时间2分钟

3.       在固定后的细胞样本上加上一滴荧光素标记的羊抗小鼠IgG(试剂2)，确定试剂覆盖了整个样本区域，室温孵育20分钟。不要让样本上的试剂变干，否则会造成非特异性染色。

4.       使用磷酸盐缓冲液清洗玻片2次，总时间2分钟

5.       室温干燥

6.       在玻片中心样本区域滴上一滴封片剂(试剂3)，盖上盖玻片，同时避免产生气泡。

注：二步染色法不推荐用于杂交瘤细胞，此类细胞分泌的抗体可被荧光素标记的羊抗小鼠IgG检测出。这种情况系，因背景染色将过高而影响支原体污染检测。检测杂交瘤细胞中的支原体是推荐使用一步法。

请严格按照推荐的步骤制备样本，任何修改都可能造成结果的灵敏度降低。

不可使用细胞离心涂片器制备样本，否则将会造成检测的灵敏度降级

7.3 质控

拆开质控玻片包装，2个玻片均按照7.1至7.2步骤制备好，一片为阳性质控品，一片为阴性质控品。

7.4 镜检

使用荧光显微镜观察样本玻片。染色后的支原体可在400-600倍下清除可视。好的样本可在染色后立刻读片。

8          需要自备的实际和设备

8.1 试剂

• 固定用的70%乙醇
• 清洗染色样本用的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)

8.2 配件和设备

• 带有荧光过滤系统和可放大400-600倍的荧光显微镜 (最大激发波长490 nm，平均发射波长520 nm)
• 低速离心机(非必须的) 用于浓缩细胞
• 恒温箱 (50^oC)
• 镀膜显微玻片 (最好为Teflon 或PTFE镀膜的玻片如MP货号6040805, 6041805, 6041205 or 6041505)
• 洗浴设备
• 盖玻片

9          结果

感染的细胞上或细胞间可见黄绿色荧光（细胞间见亮红色）。支原体应不可见于样本中的所有细胞。多数情况下支原体主要集中于细胞表面的某一点。基于现在样本中发现的支原体种类，染色后的支原体形体改变很小，带有明亮荧光的球状变为短丝状可能是染色弥漫

10     敏感性和特异性

使用一步法比较微生物法(培养法)测定42种不同来源细胞系的支原体感染的独立研究，结果见下：

Mycoplasma Infection

* 本研究中唯一的假阳性结果发生于昆虫细胞系，本试剂盒能否用于昆虫细胞检测需评估。 

11     参考文献

1. Blazek, R, Schmitt, K., Krafft, U., Hadding, U.: "Fast and simple procedure for the detection of cell culture mycoplasmas using a single monoclonal antibody." J. of Immunological Methods, v. 131(1990) 203-212.

2. Kamla, V., Henrich, B., Hadding, U.: "Species differentiation of mycoplasmas by EF-Tu specific monoclonal anitbodies." J. of Immunological Methods, v. 147 (1992) 73-81.

3. Hopert, et. al. "Specificity and sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in comparison with other methods for detection of mycoplasma contamination in cell lines." Journal of Immunological Methods, 164 (1993) 91-100.

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