PCR原理与应用

　　聚合酶链反应 (PolymeraseChainReactionm,PCR)是一项体外基因扩增技术,1985年美国PE公司人类遗传研究室发明了该项技术,Saiki等首先应用于镰状红细胞贫血的产前诊断,但由于操作方法繁琐未能全面推广应用。直到1988年耐热DNA聚合酶(Taq酶)的发现和应用, 使PCR技术变得极为简单,才被迅速应用于分子生物学、生物工程、医学、法医学和农学等领域,PCR技术已经作为分子生物学发展道路上一个里程碑，永载史册。

　　(一)PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 ② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的50年代初Zamecnik等在形态学和分离的亚细胞组分实验中已发现微粒体(microsome)是细胞内蛋白质合成的部位;1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设;1961年Brenner及Gross等观察了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体的结合;1965年Holley首次测出了酵母丙氨酸tRNA的一级结构;特别是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码，随后研究表明这套遗传密码在生物界具有通用性，从而认识了蛋白质翻译合成的基本过程。从分子生物学的发展过程，可以看到在近半个世纪中它是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域，推动着整个生命科学的发展。至今分子生物学仍在迅速发展中，新成果、新技术不断涌现，但分子生物学的历史还短，积累的资料还不够。例如：在地球上千姿万态的生物携带庞大的生命信息，迄今人类所了解的只是极少的一部分，还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律;又如即使到2005年我们已经获得人类基因组DNA3×109bp的全序列，确定了人的5-10万个基因的一级结构，但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调，要理解80%以上不为蛋白质编码的序列的作用等等，都还要经历漫长的研究道路。可以说分子生物学的发展前景光辉灿烂，道路还会艰难曲折。④、特异性强 作为引物的寡核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键。⑤、对原始材料质量要求低含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者总RNA，就可以用做反应起始材料来获取目的产物。

　　(二)PCR技术的应用1、生命科学　　a、人类基因组计划随着的PCR日臻完善，科学家于2003年在完成的人类基因组“工作框架图”的基础上，经过整理、分类和排列后得到的更加准确、清晰、完整的基因组图谱。这是对人类基因组基本面貌的首次揭示，表明科学家们开始部分“读”出人类生命“天书”所蕴涵的内容。b、后基因组计划 人类基因组DNA序列图谱完成后，鉴定基因组多态性及其单倍型以及寻找其在生物和医学应用中重要成为人们关心的热点。以研究基因功能为核心的“后基因组时代”已经来临，大规模的结构基因组、蛋白质组以及药物基因组的研究计划已经成为新的热点。c、物种的分类、进化及亲缘关系 可以进行物种进化的保守性分析及物种多态性分析、物种鉴定。2、医药　a、疾病的诊断和治疗 遗传性疾病：如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏等有遗传倾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂症、甚至肿瘤中的一部分，均可预测;癌基因的检测和诊断：检测恶性肿瘤的标记物来诊断癌症等疾病;利用基因治疗方法治疗肿瘤性疾病。b、致病病原体的检测 检测范围包括细菌、病毒(SARS及禽流感病毒H5N1等)、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法，所需时间也已达到临床要求，这对于难于培养的病毒(乙肝)，细菌(如结核、厌氧菌)和原虫(如梅毒螺旋体)等来说尤为适用。c、DNA 指纹、个体识别(DNA身份证)、亲子关系鉴别和法医物证可以用一根头发、一个细胞、一个精子来完成上述工作，这一领域也已发展到骨髓或脏器移植配型。 d、生物工程制药 许多药物可通过工程菌和细胞来大量生产，如干扰素、白介素、促红细胞生长素等药物。e、转基因动物制药及疾病模型 转基因动物与医学及生物医药研究的关系越来越密切。近年来,各种人类疾病转基因动物模型不断建立。如转基因动物在遗传病、心血管疾病、肿瘤、高血压病、病毒性疾病、异种移植、输血医学、药理学研究中的应用;利用转基因动物-乳腺生物反应器生产药物蛋白,好比在动物身上建“药厂”,可以从动物乳汁中源源不断地获得具有稳定生物活性的基因产品。这是一种全新的药物生产模式,具有投资成本低,药物研制周期短和经济效益高等优点。 f、中药材真伪鉴别　利用DNA分子的特征进行物种鉴别的DNA分子标记鉴别法,与现有的中药鉴别方法相比具有以下主要特点:1)准确性高、重现性好,真实、稳定、可靠;2)不受样品形态的限制,原药材、饮片、粉末乃至含有生药原型的中成药(丸剂、散剂等)均可应用;3)所需检样量少,对珍稀药材及化石标本的鉴定更具应用价值;4)PCR技术的快速、便捷性使得DNA分子标记鉴别法更适宜推广使用。3、农业科学 a、转基因植物 按其功能主要分提高产量、抗病力、抗除草剂、改良品质和发育调节。如:大豆、玉米、马铃薯、番茄等。b、转基因动物 在农业方面，主要在改良畜禽生产性状,提高畜禽抗病力及利用转基因畜禽生产非常规畜产品。4、环境科学 a、环境生态研究 PCR-FLP技术为环境地球化学提供了一种新的研究方法和实验设计的新的思维方式。此方法具有所需样品量低、快速简便及特征性强等优点,可广泛应用于物质的生物地球化学循环、环境过程的生物作用、生物多样性及有机物源判断等方面的研究。展望未来研究成果,将会在海洋及湖泊沉积物等自然环境中发现更多的、新的微生物种类;将进一步阐明生物作用和物质循环的机理和过程;进一步阐明自然环境中生物大分子的变化机理及其环境效应并找到判断沉积物有机物。b、环境监测 长期以来检测外环境(水样中的霍乱弧菌、空气中产气荚膜杆菌、海洋中已知病菌及有害生物如藻类等)均用传统的分离培养方法,既繁琐耗时,检出率又低，而用 PCR方法能快速、准确地检测外环境致病性细菌盒有害生物。5、考古学及历史事件解读 利用人类短串联重复STR-PCR技术，研究人类种族的遗传多态性，效果非常稳定。目前此技术已广泛用于生物考古、种系发育、民族学、人类学和考古学等各个领域中。 6、卫生安全 a、食品微生物的检测 传统的致病菌检测首先经过长时间的培养，费时费力，应用PCR技术则非常迅速、准确。主要用于：食品致病菌的检测，如肉毒唆菌等;乳酸菌的检测;水中细菌指标测定。b、转基因食品的检测 目前世界转基因食品已经有100多物种，大多数已经用于食品。转基因食品对人体健康的危害及对生态的影响也日受世界广泛的重视，因此对转基因食品的检测成为控制其泛滥的一种手段。c、动、植物检疫　灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口口岸的门卫，检查出入国门的人员、动、植物(种畜、种籽)等是否携带烈性传染病(艾滋、动物病毒、植物病毒等)病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段将这些病菌拒之于国门之外，是提高我国综合国力的必要保证。