一些常见生物实验小技巧

　　SDS-PAGE

　　1. SDS-PAGE配制过程中，浓缩胶与分离胶可预先配好大体积(如100ml)预制胶，储存在4度冰箱(注：10% APS，TEMED不加)，每次配置时只需吸取所需体积的预制胶加入相应体积APS，TEMED即可，预制胶可储存半年以上，能节省很多时间，更重要的是，可大大减少与丙稀酰胺的接触，减少中毒。。

　　2. 配胶过程中，普通的SDS-PAGE中加入约13%的甘油，可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。改进过程只需将配方中的水改成60%的甘油即可。。

　　3. 配好后，若过夜使用，待凝聚后不要拔下梳子，把含胶玻璃板从制胶槽取下，注意玻璃板上下两边缘会有气体，所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发，用保鲜膜包上，然后放4度过夜，第二天在电泳槽内直接拔下梳子即可使用。

　　4. 分离胶用水压胶不平时，可以换用乙醇(浓度无要求，干净即可)，效果较好。

　　5. 配置分离胶时因胶凝时收缩常导致加样孔变浅，可以将加剩的胶放入4℃以降低凝聚速度，而将凝胶放入37度促聚，并随时用4℃加剩的胶补充下降的胶面;另外将胶横放与水平面成10度角也可以减少收缩的影响。

　　6. 丙烯酰胺放置时间过长(超过一年)，会吸水潮解，导致胶不凝。。

　　7. 凝胶时温度高凝胶快，但过高时，会影响交连物的孔径大小，25℃为宜。

　　8. 氧气是胶凝固的终止剂，所以尽量避免胶中气泡出现。。

　　9. 大肠表达检测时，一般要煮样，但煮出来时常较稠，用8M尿素重悬细胞后再煮效果较好。

　　10. 配好的10×TBE经过高压灭菌后，不会形成沉淀，可以用很长时间，而且跑出的条带也很漂亮。

　　11. 上样时，最后保证上样量一样，包括体积，当体积不同时，可以加缓冲液补全，这样跑出的胶较为一致。所有的加样孔都加样，可以防止边缘的样品拖尾，如样品不多，其余的孔均用上样缓冲液加满，防止影响条带扩散。

　　12. 跑胶时，因为低电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形，所以低电压泳道会比高电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。。

　　13. 跑胶过程中，为节省时间，可以提高电压，但得注意散热，可以冰浴跑胶，将电泳槽放入盛有冰水的盆中，或是冰箱中，节省的时间的同时，效果也较好。。

　　14. 防止条带跑歪：分离胶配好后4度过夜;在点样的时候紧靠于上样两边的点样孔各上20微上样缓冲液。

　　15. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，用流水冲玻璃板的缝隙处(也就是凝胶部分)，一边冲一边轻轻掀起玻板，用水去充满玻板和胶之间的缝隙，很容易能把玻板掀开。接下来把玻板反过来，让胶面朝下，使其一端浸入到一个盛着水的大平皿中，轻轻晃动，胶很快就会被水带到平皿中了，丝毫不会损伤胶。。

　　16. 染色时，为节省染色时间，可以先将染色液在微波炉内加热5-10秒，不能太久，避免冰醋酸挥发，然后在水平摇床上放置半个小时即可染色好。如果是旧染色液，隔十分钟加热一次。。

　　17. 脱色时，可不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉中高火里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次即可。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料(用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液)。。

　　18. 用硝酸银染色，那么显色时如果迟迟不出现条带，可以再显色夜里加一点甲醛。如果染色或显色没有做好，染成了海带胶，我们可以复染。将胶用一蒸水清洗7.8遍，再重新染色，显色。

　　质粒提取

　　1. 质粒提取时，最后一步的酒精挥发对后续酶切等至关重要，尽量延长挥发时间，最好是在空调的热风中挥发。

　　2. 加速燥的方法，70%乙醇清洗过后，再加无水乙醇清洗再倒掉无水乙醇，加速挥发。。

　　3. 利用试剂盒中硅胶柱手提质粒，手提质粒时，配置的溶液一、溶液二、溶液三(代替试剂盒的solution1、2、3)，然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠(代替结合缓冲液)混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而只要是一样的质粒，试剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制。。

　　4. 质粒提取的最后一步用TE(水)洗硅胶时，一般是加水后放置一分钟，再离心收集DNA。可以加水后当即离心，再次把离心收集的液体重新加到硅胶柱上，放置一分钟，离心，这样得到的质粒的回收率要高出10~30%，另外，同一种质粒，用过的柱子可以反复使用(5次)。 。

　　Western Blot

　　1. Western Blot在摸索一抗、二抗浓度，封闭时间，曝光时间等条件时，可以一次转膜后，将膜晾干，裁减成小块保存，每次取一小块进行条件摸索，可以避免每次都重新跑胶、转膜甚至是重新提取蛋白，可以节省大量时间。

　　2. Western Blot时，转膜后暂存晾干的膜于4℃条件下比将蛋白保存在Buffer中更可靠。。

　　溶液配制

　　1. 培养基试剂等配制过程中可先将各成分配成母液，并在常用试剂瓶上写上该试剂配方，方便配制。

　　2. 剧毒物质配制过程中，以往是先根据要配的浓度与所需体积算好待称物质的量，其实可以先称好有毒物质，再去调整溶剂的体积，以避免长时间与有毒物质接触。。

　　PCR、酶切、连接并进行凝胶检测。

　　1. PCR，酶切时，可以将反应液除模板，引物，酶的其他成分配预混合制成Mix形式，储贮在-20℃冰箱中，用时取出分装，可以避免每次条件不均。。

　　2. 菌落或菌液直接PCR时，预变性的时间延长至5min，效果较好。

　　3. PCR 的循环参数的第一步都是94或95度预热3~5分钟，延伸一般都是72℃，按照这些参数做PCR一般都可以做出来，但在长片段PCR(>2kb) 中，由于DNA模板在94℃高温20秒以上就会发生脱嘌呤反应，当taq酶遇到模板上的这些错误时就会停下来从而使反应不能继续进行，时间越长，模板损坏也越严重，得不到产物的可能性也越大，另外，对于我们实验中用到的许多taq酶来说，72℃并不是其最佳的反应温度。如Takara LA酶的最适反应温度是68℃，采用92℃预热3分钟，95℃变性15-20秒，退火后于68℃延伸取得很好的效果，扩过最长的片段为10kb。。

　　4. 双酶切时，两个酶单独酶切效果要好很多。在第一个酶切完成后，将体系热失活(根据说明书，一般65℃，20min)，再进行第二个酶切。。

　　5. 提高酶切效率的方法，将要进行酶切的质粒DNA直接放于95℃的水浴锅中10 s，取出自然放冷，再加样进行酶切。

　　6. 高GC含量的酶切位点如NotI，应该用甲基化缺陷的宿主菌如E.coli Top10等。

　　7. 用酶切作检测时，在微波炉里面加热1min即可跑胶检测，双酶切可以考虑2min，但酶切不够充分，回收量可能不够。

　　8. 琼脂糖凝胶跑完后可以二次点样。。

　　9. 跑胶过程中，先100V电压跑约15min，再将电压调大至120-130V，进行较小差异电泳，可以避免大片段残存在胶孔不动的情况，跑出来的带较为漂亮且省时。。

　　10. 做连接时，连接buffer一定要避免反复冻融，可在第一次用时就分装成小份，三次以上冻融会大大降低连接效率。

　　RNA提取与检测

　　1. RNA电泳过程中，预电泳5-10min 减少了非特异RNA条带的出现，有利于分离和纯化，同时可根据电泳仪是否冒泡判断电泳仪装置是否有误。。

　　2. RNA 点样过程中，样品是在电泳缓冲液液略低于胶表面而不是在高过胶面时加进齿槽，避免了加样时RNA 的扩散、加样后RNA 从齿槽逸出造成RNA的弥散及定位不良等现象。电3-5min 让RNA进入凝胶后再加电泳缓冲液液高过表面，确保了加到每个槽中的RNA量及定位的准确性，从而有利于RNA的鉴定和纯化。(亦适合于DNA)。

　　其他

　　1. 超滤对于按照分子量进行初分离的效果不是很好，但很适合用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐。

　　2. 蛋白质纯化时，蛋白质降解可能与超声破菌保持冰浴有关，之前建议加PMSF(剧毒，蛋白降解抑制剂)，建议在上柱子洗脱的时候也加PMSF，一定要用之前再加。。

　　3. 垂直电泳时，可在电泳糟中放入青霉素小瓶等，可使液面提高而不影响电泳，又很节约电泳缓冲液。

　　4. 柱层析时，如果样品较多，可以将样放在三角瓶中，用一个输液管与柱上端连通，并持平，用枪头引导液体流出，调好流速。。

　　5. 细胞培养过程中，传代时，不用吹打或刮落，先将上清吸出，适当拍打培养瓶，即可见贴壁细胞脱落，加培养基混悬即可。

　　6. 96孔板上气泡的去除方便快捷的方法，用吹风机直接对着板用热风吹，1~2s见效。

　　7. 倒制平板时，避免皿盖上的水汽的方法，在倒制培养基平板时，将倒制的平板迅速的摞在一起;如果条件允许，可以在最上面放置一个倒有半培养皿热水的培养皿，静置至平板培养基凝固完全。。

　　19. 脱色时用0.25M NaCl代替脱色液，效果较好，无毒。。

　　20. 脱色时，在脱色液中加入娄张捏成条状的擦镜纸或是面巾纸，由于染料吸附到纸纤维上，可以加速脱色，待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。。