细菌DNA的分离提取方法

　　细菌DNA的分离提取方法：

　　一、原理和用途

　　用EDTA络合二价离子，SDS结合膜蛋白，溶菌酶破坏膜结构，使DNA溢出到膜外，经氯仿异戊醇沉淀蛋白，可获得较纯净的DNA。用于克隆细菌染色体上的目的基因、检测细菌的污染、绘制基因图谱等

　　二、细菌DNA的分离提取溶液及其缓冲液的配制

　　1、LB液体培养基，PH调到适当，高压灭菌

　　2、SE溶液：含有0.15mol/L氯化钠和0.1mol/LEDTA(ph8.0)

　　3、20%SDS

　　4、溶菌酶

　　5、5mol/L过氯酸钠

　　6、氯仿-异戊醇：氯仿：异戊醇=24:1

　　7、20倍的SSC溶液：含0.3mol/L柠檬酸钠和3mol/L的氯化钠

　　8、10mg/mLRNA酶：称取10mg核酸核酸酶A于灭菌的EP管内，加入1ml100mmol/LPH5.0的醋酸钠溶液，即为10mg/mLRNA酶，为了消除脱氧核酸核酸酶的影响，置于80℃的水浴中10min或者100℃水浴中2min，然后于-20℃下保存

　　9、无水乙醇和70%的乙醇

　　10、TE溶液：含10mmol/LTRIS.HCl(PH8.0)和1mmol/LEDTA

　　11、10mg/mL溴化乙锭染色液

　　12、溴酚蓝电泳上样缓冲液

　　三、细菌DNA的分离提取方法和步骤：

　　1、将200mlLB液体培养基中生长的细菌菌液以4000r/MIN离心10min，收集菌体

　　2、用SE溶液洗剂菌体，重悬于20mlSE溶液中

　　3、加入2.0ml20%SDS、10mg溶菌酶，混匀，37℃保温，不时震荡，菌体溶解(30-60min)后，置于60℃水浴中10min

　　4、加入5mol/L过氯酸钠至终浓度为1mol/L，再加入1倍体积的氯仿-异戊醇，缓慢震荡20min，以12000r/MIN离心5min

　　5、转移水相到另一个离心管中，加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，用玻璃棒轻轻缠出DNA细丝，加入70%的冷乙醇300ul清洗

　　6、将玻璃棒置于离心管中，用0.1倍SSC溶液冲洗，使DNA溶解，然后用20倍SSC溶液调整浓度为1倍SSC

　　7、加入2倍体积的冷无水乙醇，室温混匀，-20℃放置30min

　　8、4℃下以12000r/min离心5分钟，小心除去上清，除尽壁液

　　9、加入70%的冷乙醇300ul清洗沉淀，4℃下以12000r/min离心5分钟，小心除去上清，除尽壁液

　　10、加入28ulTE溶液、2ulRNA酶

　　11、制取0.7%的琼脂糖凝胶板

　　12、凝胶冷却后，加入缓冲液至淹没平板，

　　13、50V/CM进行电泳，回收凝胶