玫瑰花环试验基本原理

　　基本原理

　　玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E—玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体，所以不能形成E—玫瑰花环，以资鉴别。

　　材料与试剂

　　1.肝素抗凝剂

　　2.淋巴细胞分层液 配制方法见细胞分离技术。

　　3.无Ca2+、Mg2+ Hank’s液 NaCl 4.00g NaHCO3 0.175g KCl 0.20g Na2HPO4.12H2O 0.076g KH2PO4 0.030g 葡萄糖 0.50g H2O加至 500.00ml 用5.6%NaHCO3调pH至7.2，115℃15min灭菌。4℃贮藏备用。

　　4.5.6%NaHCO3液 NaHCO3 5.60g H2O 100.00ml 115℃20min灭菌, 4℃贮藏备用。

　　5.0.8%戊二醛溶液 25%戊二醛溶液 0.32ml Hank’s液 9.68ml 用前配制。 6.Giemsa—weight染色液 Giemsa粉 0.03g Weight粉 0.30g 甲醇 100.00ml 先将染料一起放入研钵内，加入少量甲醇，研磨细，然后倒入瓶内，并用甲醇冲洗研钵内染料，一起倒入玻瓶内，补足甲醇量，备用。

　　操作方法

　　1.取肝素抗凝血2ml，置37℃水浴自然沉淀30min～40min，吸取全部血浆(约1ml)。 2.于血浆中加Hank’s液数毫升，洗涤，1 500r/min离心5min～10min，弃上清。重复洗涤4次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。 3.采绵羊肝素抗凝血，加数倍Hank’s液，洗涤3次，最后以Hank’s配成10%悬液，4℃保存。 4.取0.1ml淋巴细胞悬液，加10%红血球悬液0.1ml，加小牛血清0.1ml。 5.37℃水浴10min，低速离心(600r/min)5min。 6.吸弃多余的上清液后，放入4℃冰箱2h～4h。 7.取出后，将沉淀轻轻摇起，加0.8%戊二醛0.1ml，混匀后4℃固定15min。 8.将干净的玻片用Hank’s液沾湿，滴一小滴混悬液，让其自然散开即可。 9.自然干燥后，用姬姆萨—瑞氏液(Giomsa—weight)或苏木精—伊红染色，水洗，干燥镜检。 结果判定 凡一个淋巴细胞结合3个或3个以上的红细胞者为一个E—玫瑰环。检查200个淋巴细胞，计算其玫瑰花环形成率。

　　注意事项

　　1.影响E—玫瑰花环试验最主要的因素淋巴细胞和红细胞的新鲜程度，被检血样必须新鲜，无菌，采血后要求在3h～4h内进行检验，否则由于淋巴细胞的死亡，受体脱落，影响检查结果。红细胞用阿氏液保存最多不要超过3周，且不应溶血。 2.控制好反应温度、时间等条件对玫瑰花环形成率有较大影响。选37℃作用10min，低速离心5min，置4℃ 2h～4h，其结果稳定性较好，结合率较高。如在37℃作用时间较长，可见玫瑰花环发生变形，结合部位松弛、拉开，甚至解离。 3.指示红血球的动物种类也与玫瑰花环的形成率有关。如马淋巴细胞与豚鼠红细胞结合较好，而驴则与绵羊红血球结合较好。Melinda氏报道，人、马、牛、猪、狗、猫、鼠与豚鼠红细胞的结合率都高于绵羊红细胞的结合率。 4.加犊牛血清能增加玫瑰花环形成细胞的稳定性，增强与指示红细胞结合的牢固性。 5.Hank’s液的pH以7.2～7.4为宜。