DH10Bac感受态细胞制备发方法

　　前言：DH10Bac感受态细胞本身含有卡那霉素和四环素抗性。在制作感受态细胞的时候，需要加入这两种抗生素，以防止DH10Bac中的质粒父本杆粒bMON14272(卡那霉素抗性)和辅助质粒pMON7124(四环素抗性)在细胞扩增过程中丢失，提高质粒转化后的基因转座效率。

　　实验步骤：

　　1. 在含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的LB平板或无抗平板上，使用DH10Bac菌液划线，37oC培养箱过夜，培养12~20小时。

　　2. 从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养3-6小时，至OD600值为0.4左右。

　　或者从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的5 ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养12小时，然后再将菌液按照1:100的比列接种于含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液体培养基中，于37oC，250rpm培养3小时，至OD600值为0.4左右。

　　3. 将DH10Bac细菌培养烧瓶在冰上孵育10 min，使培养物冷却至0℃，转入无菌的预先用冰预冷的50 ml离心管中，然后于4℃下5000 rpm离心8 分钟收集细胞。

　　4. 倒出培养液，尽量使上清弃尽。每50 ml初始培养物加入30 ml预先用冰预冷的0.1 M CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟。

　　5. 于4℃，5000 rpm离心8 分钟收集细胞，弃尽上清。加入4 ml预先用冰遇冷的0.1 M CaCl2。轻轻吹打悬浮细胞，加入1 ml灭菌的预先用冰遇冷的80%甘油，吹打混匀。

　　6. 将DH10Bac感受态细胞按照毎管100 ul分装。可以直接使用新鲜制备的DH10 BAc感受态细胞进行质粒转化，也可以放在-80 ℃冰箱保存备用。

　　备注：

　　1. DH10Bac感受态细胞制备的整个过程中应当严格无菌操作。

　　2. 提前配制包含工作浓度为50 ug /ml的卡那霉素和10 ug/ml的四环素的LB培养基100 ml，其中添加100 mg /ml的卡那霉素50 ul，10 mg/ml的四环素100 ul。

　　3. 悬浮、分装细胞时，预先将枪头预冷，EP管事先标明清楚并置于4℃或-20℃冰箱预冷。

　　4. DH10Bac感受态细胞喜冷不喜热，严格执行冰上操作步骤，保证整个过程中感受态细胞的低温状态时获得高效感受态细胞的关键。

　　5. 用于转座的pFastBac1等载体自身含有庆大霉素的抗性，并且转座是否成功可以通过蓝白斑进行筛选，因此在使用pFastbac1载体质粒进行DH10Bac感受态细胞转化时平板应该使用含有卡那霉素，四环素抗性和庆大霉素的三抗平板。同时，在平板中加入IPTG和X-gal以进行蓝白斑筛选，鉴定转座是否成功。