奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

上一篇 / 下一篇 2013-01-28 00:23:19

北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。
]F$n8B$g7B C:lE0本文采用天津博纳艾杰尔科技的Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（货号：MS-DI5001）和Venusil^® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。

实验部分
0\2`b:o*z\0仪器和试剂分析测试百科网I9cL9ql;t!f"y#\
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。分析测试百科网r0wZ!TP-D5[.l
双氰胺标准品，Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。
NsdEZ^*~0H ^R5m(g;f0实验方法
.j+y{K{$im:L_ V0提取、净化分析测试百科网i6T/Pw9]8E6M
称取1g试样于50ml具塞离心管中，加入2ml水溶解后，加乙腈定容至10ml，超声10min，8000r/min离心5min，取2ml上清液加Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管中，，涡旋0.5min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22um滤膜，待测。
0`} b)W O|)wz0分析测试百科网hX@([5f)sD
HPLC法：
[S*AMB)z B1S4k0
2L`x Q`d C n/_kOL0色谱条件：
CM7P JE0_0色谱柱：Venusil^® HILIC 5μm 100Å 4.6*250mm；
流动相：A：10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）；分析测试百科网 `j#i$h6?'b4{
B：乙腈；
:[~6wg1vQq0A：B=10:90；分析测试百科网 N'Ivk3m-C
检测波长：220nm；
7m`*|!{@@*`7i^~ew`0进样量：10µl；
t/n? @8? d a![s0柱温：30℃；
V E5WLR&Ah^Nd0流速：1ml/min。分析测试百科网1hBNB7y+[3Q4A
分析测试百科网1sH8~+?/U}
实验结果：分析测试百科网Z#?QKr#G5y
线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；
kY\0@z7Gm0分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为0.1µg/ml，0.5µg/ml，1.0µg/ml，2.0µg/ml，5.0µg/ml和10.0µg/ml的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表2：

表2 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	4.92min	Y=116.44X+3.2699	0.9997	0.1µg/ml

分析测试百科网}}5V `7o0I iH
检测方法稳定性考察分析测试百科网Qren2en7b.]_
选用10.0µg/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表3：

表3 检测方法定性和定量稳定性考察考察（HPLC法）

标号	保留时间，min	峰面积
1	4.930	1061.7
2	4.933	1072.2
3	4.930	1064.4
4	4.929	1079.7
5	4.930	1067.3
6	4.934	1073.6
RSD，%	0.04	0.62

Y&r ew@-I9A/~0准确度和精密度分析测试百科网Mz@a7^"[w
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表4

表4 10µg/g添加回收实验结果（HPLC法）

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
98.6	88.4	89.8	92.3	5.99

分析测试百科网"Q-J0B {\{&xCc
LC-MS/MS法：分析测试百科网.ZK jQ0E@{
分析测试百科网U O|fi6M~
色谱条件：分析测试百科网M*w%?dk c4jX;f
色谱柱：Venusil^® HILIC 5μm 100Å 2.1*150mm；
dc.YS,w0流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）分析测试百科网.E$Y1B9d!tQ
B：乙腈
j!jd9Br8pcv0A：B=10:90
l!b@,@Oab"K)F0进样量：10µl；
e'Yx @8`M"NgT0柱温：30℃；分析测试百科网s5Z9F7S+l'z3cx"~
流速：0.2 ml/min。
{cE'F,g|#ZV0分析测试百科网L+|zU&r
质谱条件分析测试百科网!f8AhT1p
质谱仪：API 4000+；分析测试百科网ny HL#R1yX
离子源：电喷雾离子源；分析测试百科网~LZ1FY0S2t'l e
扫描方式：正离子扫描；分析测试百科网ckfVt_V(\T
检测方式：多反应监测；分析测试百科网]9Fu,r)\@.PA4V
CAD：8.00；
3E|*V-?7gP6~0CUR：10.00；分析测试百科网^_`Ou~w
GS1：60.00；分析测试百科网ze:dC"B0Sawfb
GS2：50.00；分析测试百科网_3^r$z.z_X%C
IS：5500.00；
aVxpu(mM} B0TEM：500.00。

表5 双氰胺质谱信息

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85/68	71	10	41	6
	85/43	71	10	41	6

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

实验结果分析测试百科网2F+f)OEe)KRW
线性关系和检出限
+D:| HO\q?&m:m0准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
CWz9T)R(su0分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和500ng/ml的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表6：

表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	3.15min	Y=8777.2X+7435.9	0.9993	5ng/ml

检测方法稳定性考察
c,qmMe0iH ^0选用50.0ng/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表7：

表7 检测方法定性和定量稳定性考察考察（LC-MS/MS法）

标号	保留时间，min	峰面积
1	3.29	382950
2	3.30	387950
3	3.25	382840
4	3.31	399820
5	3.30	378580
6	3.30	383810
RSD，%	0.65	1.92

FR*?:Z2N{0准确度和精密度
:}s7i(Z:Lv?0选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表8。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表8 100ng/g添加回收实验结果

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
84.6	80.7	90.2	85.2	5.61

双氰胺检测方法包订货信息

产品名称	规格型号	货号
MAS-QuChERS-双氰胺净化管	100mg/10ml，100支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC	4.6*250mm，5μm，100Å	VH952505-0
Venusil HILIC	2.1*150mm，5μm，100Å	VH951502-0
微孔滤膜	0.22μm，直径13mm,200/PK	AM021320
双氰胺对照品	1g/瓶，含量≥99.0%	DCD-0001
离心管	50mL，带螺纹盖，25个/包	L050025-C
一次性无菌注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML

附图

分析测试百科网_Ou.N;ZpL7J1\
图1 定性定量稳定性考察谱图（HPLC法）
0w e:M5`E$xKo C2?0
C*EiKs3a0图2 双氰胺0.5μg/ml标准溶液谱图（HPLC法）
Nm I"e,bw2Q0P#sF0
,W(V1cD#M7S0图3 奶粉空白谱图（HPLC法）分析测试百科网:OVW.PMm7S
分析测试百科网h'd4Oj"F PF9o@
图4 奶粉10μg/g空白谱图（HPLC法）
:z5_H4Y,L SJv0分析测试百科网3GM0f7IjW;g/L
图 5 10ng/ml双氰胺标准溶液质谱图分析测试百科网-J}ar_L ]`

i]*u%u5Q~.|X{0图 6 奶粉空白质谱图