婴幼儿奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。分析测试百科网/E:}hH$F#N
针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500mg/15mL，货号：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。
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1 实验部分分析测试百科网%b.a2KN`YT
分析测试百科网,TS;nj7BRO
1.1 仪器、试剂与材料
0e9P3V X!\Z:P0高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。
rj8N:zF N KZ{*]0双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

%X n'j+`9D"S`4s01.2 实验步骤
'h$U;w2y6e#|R0称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。

AV1@He2F#SGFD0注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；
R/_,PZ-yo4Jq3h02.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。
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1.3　实验条件分析测试百科网R"K&@O~i
1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）：
Lq5C-|m0色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；
0lu%Ml o? Uw0流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85；

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}D]0波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：0.8mL/min。
TL-fx%|{9G01.3.2 LC-MS/MS法：
&`Ob _^tQ;ed0（1）色谱条件：
?/N7h9~{U @0色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；分析测试百科网}W$m9~5c6?
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流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）
#SWYB-k6Z0B：乙腈；分析测试百科网3}7Q4r0XgI3~%q
进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。

2.结果与讨论

2.1 高效液相色谱法：
;G2L1n,n5b!F{'B b02.1.1双氰胺的液相色谱图

2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限
bdY$E+Pf+M0准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；
d7AWsqWUsIt0分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：

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2.2 LC-MS/MS法
l%G4p TD0G8Y02.2.1双氰胺的LC-MS/MS图
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8GBOm ]pjI02.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限分析测试百科网/? ` O~`8O7I
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
9F,vS@s,c0分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：

表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	2.25min	Y=3859.1X+23694	0.9900	2ng/g

2.2.3准确度和精密度
?v!j9q,CC0l9g3w@0选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。