重组DNA技术特点

　　实验室重组DNA分子制作过程包括6个基本步骤：

　　1、制备DNA。可以利用各种常规的方法从组织或细胞中分离DNA，或者是通过人工合成,方法合成。

　　2、在特定位点切割DNA。用同一种酶限制性内切酶切割外源DNA和质粒载体。

　　3、连接DNA片段。利用连接酶将从外源DNA获得的靶DNA与经同一种酶切割的质粒载体连接，构建成一个含有靶DNA的重组DNA分子，也称之重组质粒。

　　4、将重组质粒导入合适的宿主细胞。为了使重组DNA分子增殖，必须将它导入合适的宿主菌，通过细菌的繁殖，才能获得重组质粒的克隆。外源DNA分子导入宿主细胞时， 　　如果是直接导入称之遗传转化(genetic transformation)或称之转化;如果是利用一个病毒作为运载工具导入称之转染(transfection)。

　　5、重组DNA在宿主细胞内大量复制。转化的效率一般都比较低，只有少量的宿主细胞吸纳了重组质粒。由于通常载体都含有抗生素抗性基因，例如插入到质粒中的氨卞青霉素抗性基因Ampr，经在含有氨卞青霉素培养基上培养，含有重组质粒或含有原来质粒(质粒自环化)的宿主菌大量繁殖，使得插入的DNA被大量复制。在有些情况下目的基因可以在宿主细胞内表达。有效克隆和表达DNA的能力取决于选择的载体和宿主。

　　6、筛选和鉴别含有重组DNA的宿主细胞。这是基因重组的最后一道工序要从转化菌中筛选含有重组DNA的菌落并鉴定重组子的正确性。通常载体都含有有助于鉴别含有重组质粒细胞的遗传标记，有的载体含有特异的DNA序列。筛选和鉴别转化的或转染的细胞一般都涉及到遗传选择和使用探针进行的核酸杂交。如果是表达载体还要进行连接方向和表达产物的鉴定。