细菌内毒素的分析方法

　　内容摘要：气相色谱(Gc)和质谱(MS)联用法是20世纪出现的一种内毒素检测方法。此法主要依据细菌内毒素的主要毒性部分类脂A水解时产生一种3一羟基脂肪酸的物质。这种物质是内毒素所特有的，并不存在于其他自然界的物质当中。每分子的类脂A含有4mol的3一羟基脂肪酸，类脂A的平均分子量为8000。通过对这种特异性3一羟基脂肪酸的检测，可以定量检测内毒素的含量。由于仪器的限制，气质联用的方法很难成为常规的细菌内毒素检测方法。《中国药典》细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。

　　一、家兔检测法

　　1923年首先提出用家兔检测热原方法，1942年美国药典将家兔法作为药品的热原检查，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。

　　目前，对于热原的概念国内外仍未有完全统一的认识。综合国内外文献报道，普遍认为热原的本质就是细菌内毒素的脂多糖。wHO文件中同样提到，药品中的热原就是指细菌内毒素，至少在药检范围内控制内毒素就是控制热原。严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖 (1ipoplysaccharide，LPs)的结构，在药品生产质量管理规范条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。多年来研究表明，热原进人人体血液循环系统后，并不直接引起发热和其他毒性反应，但它可使细胞释放内源性热原物质。

　　这种内源性热原可直接作用于中枢神经系统，刺激体温中枢，引起机体发热。作为热原检测法的家兔检测法也就成为人们检测内毒素的最早方法。此方法将一定量的被检标本静脉注入家兔体内，观察其注射后的发热情况，以决定所检标本中有无热源存在。家兔检测法为一种定性检测内毒素的方法，应用历史较久。但随着社会的进步、科技的发展，制药工业飞速前进，新药品种不断增加，临床用药要求越来越高，家兔法局限性日益突出，如家兔对内毒素在反应上有个体差异，敏感度不高，不能定量检测内毒素等，因此家兔检测法现在已经很少使用。

　　二、气相色谱和质谱联用检测方法

　　气相色谱(Gc)和质谱(MS)联用法是20世纪出现的一种内毒素检测方法。此法主要依据细菌内毒素的主要毒性部分类脂A水解时产生一种3一羟基脂肪酸的物质。这种物质是内毒素所特有的，并不存在于其他自然界的物质当中。每分子的类脂A含有4mol的3一羟基脂肪酸，类脂A的平均分子量为8000。通过对这种特异性3一羟基脂肪酸的检测，可以定量检测内毒素的含量。由于仪器的限制，气质联用的方法很难成为常规的细菌内毒素检测方法。

　　三、《中国药典》(2005年版)细菌内毒素检查法

　　本法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法的结果为准。凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

　　光度测定法分为浊度法和显色基质法。浊度法是利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法，根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之问存在着定量关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

　　显色基质法是利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出显色团的多少而测定内毒素含量的方法，根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的显色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。