琼脂糖凝胶电泳法

　　琼脂糖凝胶电泳法 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料:凝胶电泳分：琼脂糖电泳;聚丙烯酰胺电泳

　　一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法

　　二、实验原理 • 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 •DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 • DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 • 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 • 溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。

　　注意事项： • EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 •实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，

　　三、实验材料、器具及药品 以前实验中提取的小麦总DNA和质粒样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭(EB)，6X载样缓冲液

　　四、实验步骤

　　⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。(冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。)

　　⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖(约50℃)倒入，室温冷却凝固。

　　⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。

　　⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。

　　⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。

　　⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。

　　⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。 植物总(核)DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带。质粒DNA应呈现一到三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区是样品中存有的RNA杂质。若质粒DNA样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。

　　琼脂糖电泳的优点

　　(1)琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。

　　(2)电泳速度快。

　　(3)透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。

　　(4)样品易回收，常用于制备。配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。

　　琼脂糖凝胶浓度与线性 DNA分辨范围 凝胶浓度(%) 线性DNA长度(bp) 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 常用的电泳缓冲液 缓冲液 浓贮存液(每升) Tris-乙醇(TAE) 50×：242g Tris碱57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(Ph8.0) Tris-硼酸(TBE) 5×：54g Tris碱27.5硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(Ph8.0) 4℃ 保存备用. 常用的6X载样缓冲液 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液