新式高分辨率流式技术解构内皮细胞微粒与冠状动脉疾病的关系

上一篇 / 下一篇 2014-12-17 11:28:47

新式高分辨率流式技术解构

内皮细胞微粒与冠状动脉疾病的关系

关键词：循环微粒（circulating microparticle, cMP），冠状动脉疾病（Coronary Artery Disease, CAD），循环微粒检测

什么是循环微粒﹖

循环微粒（circulating microparticle, cMP）是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡。cMP的直径约为0.1μm - 1μm，膜表面暴露着带负电的磷脂酰丝氨酸（posphatidylserine, PS）以及细胞来源特异的膜表面抗原。这些特征将循环微粒区别于凋亡小体（apoptotic body）和外来体（exosome），凋亡小体是细胞凋亡时以出芽方式形成的，直径大于1μm；而外来体来源于细胞内的多泡小体（multivesicular bodies），以外分泌的形式释放出来，直径大小为30nm - 100nm 。

根据微粒的来源，可以将微粒分为血小板微粒（platelet microparticles, PMPs）、红细胞微粒（erythrocyte microparticles, Ery-MPs）、内皮细胞微粒（endothelial cell microparticles, EMPs）、粒细胞微粒（granulocyte microparticles, GMPs）及淋巴细胞微粒（lymphocyte-derived microparticles, LMPs）等。研究证实，在健康人群中，PMPs在循环血液中所占的比例最大，其次是Ery-MPs。以往认为微粒只是单纯的无活性的细胞碎片，但越来越多研究表明cMP在生理和病理情况下充当着重要的角色，尤其在抗凝、促炎、内皮损伤、血管收缩、诱导血管生长以及免疫调节等方面起重要作用，在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现循环微粒水平的升高，对于它的认识还在不断地探索，其研究也越来越多。

循环微粒在冠状动脉疾病中的研究

冠状动脉疾病（Coronary Artery Disease, CAD）是心脏疾病的主要类型，也是导致心脏病发作的主要原因，它是由于粥样斑块在动脉内壁上的累积，导致动脉管腔变小，血流减少。CAD的发展非常缓慢，大多数病人可能几十年都没有明显的症状，直到有一天突然心脏病发作。因此，对CAD的早期诊断可以大大降低病人心脏病发作的风险，传统的诊断方法包括心电图、量血压、血管造影等，但这些方法都只能在比较晚期的时候起作用。研究发现，血管内皮细胞机能障碍是CAD发展过程中的一个重要因素，而内皮细胞微粒（EMPs）是判断内皮细胞功能的一个新的生物标记物。实际上，许多研

	究发现，心血管病人血液中EMPs的水平高于健康人群。最近，北京协和医学院的有研究发现，CAD病人血液中CD62E阳性的小内皮细胞微粒（small-size endothelial microparticles , SEMPs , diameter < 0.5μm）的比例显着高于健康对照组（Fig. 1），是一个潜在的反映CAD病人内皮细胞功能的生物标志物[1]。
	Fig. 1. Percentage of CD62E+ SEMPs in CAD patients and healthy subjects. The graph shows the mean percentage of CD62E+ SEMPs in blood samples obtained from CAD patients and healthy subjects. *P<0.05.

循环微粒的检测方法

目前cMP的检测方法主要有激光共聚焦显微镜、扫描和透射电子显微镜、原子力显微镜、流式细胞仪和ELISA等，由于通量高、操作简单，ELISA和流式细胞仪是比较常用的方法。ELISA方法容易受其他可溶性抗原的干扰，而且无法知道微粒的大小、数量等信息。流式细胞仪提供了更有效、快捷的微粒分析能力，现已有多种流式细胞标记物可用于微粒检测，它们主要用于检测微粒的活化状态及其细胞来源。但传统流式细胞仪的检测极限通常是0.5μm，由于无法与背景噪音区分，直径小于0.3μm-0.5μm的微粒难以检测。

新式高分辨率流式细胞仪在检测循环微粒的优势

英国Apogee公司的A50高分辨率流式细胞仪突破传统流式细胞仪的检测极限，优化的光学模块和优异的散射光检测能力使得A50具有检测小颗粒的最高灵敏度（100nm）和最好的光散射分辨率（10nm）。Fig.2展示的是Apogee与传统流式细胞仪的技术对比，可以看到FC500和LSRII只能勉强区分0.5μm和0.6μm的微珠，0.5μm以下的微珠完全无法区分，而Apogee可以轻松地将0.2μm的微珠和0.4μm的微珠分成两个群。由于检测能力的限制，FC500和LSRII只能检测到部分的0.2μm和0.4μm的微珠，对于0.2μm的微珠，LSRII和FC500的丢失率分别达到79%和96%；对于0.4μm的微珠，丢失率也分别达到12%和56% [2]。相反的，利用Apogee A50突出的高灵敏度和分辨率，可以清晰的将直径相差10nm以上的微粒样本进行分群、计数、分析。另外，多达9通道荧光检测器，可以灵活使用cMP特定

抗原荧光抗体进行微粒来源、数量的精确分析。

Apogee A50是市场上唯一能检测小至100nm小颗

粒的流式细胞仪，在循环微粒的检测上优于传统流式细胞仪。

Fig. 2. Size resolvability of different flow cytometers using polystyrene microspheres. Graphs show forward scatter relative intensity for 0.2 - 0.8μm polystyrene microspheres for three flow cytometers.

Apogee A50的应用展望

cMP作为细胞凋亡或者活化后形成的细胞脱落产物，在不同程度上反映了疾病的病理状态。微粒在免疫调节、慢性炎症方面将会是今后研究的重点，对不同状态下微粒的形成机制以及它们的生物活性的研究将是今后研究的难点。在糖尿病、高血压、心血管、血液系统乃至妇产科方面疾病的运用，将会使微粒成为临床上一种新的诊疗手段。而Apogee A50超高的灵敏度和分辨率将帮助我们更好地进行微粒的研究，甚至诊断！

[1] Hu S-S, Zhang H-G, Zhang Q-J, Xiu R-J (2014) Small-Size Circulating Endothelial Microparticles in Coronary Artery Disease. PLoS ONE 9(8): e104528.
[2]Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost 2011; 9: 1216–24.

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