EHEC O157:H7的检验
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下一篇 2013-02-15 17:20:42
1、培养基制备:
改良EC新生霉素增菌肉汤 (mEC)
EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素,使终浓度为20μg/mL。
改良山梨醇麦康凯琼脂(TC-SMAC)
山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液,使终浓度2.5mg/L,头孢克污,使终浓度为0.05mg/L。
MUG-LST肉汤
LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG),使终浓度为0.1g/L。
2、增菌培养
秤取25克样品放入225mL mEC中,均质。于41±1℃培养18-24小时。
3、分离
将mEC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4,10-5,10-6稀释度,各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培养18~24小时。可疑 EHEC O157:H7菌落扁平,透明或半透明,边缘光滑,呈淡褐色中心,直径约2mm。
4、鉴定
挑取TC-SMAC上的可疑菌落,接种MUG-LST,于36±1℃培养18~24小时,出现产气,且无荧光者,分离到普通营养琼脂。
对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验,必要时进行生化试验。
在检测过程中,也可以在选择性增菌后,取出5mL增菌液,经100℃水浴15分钟灭活后,供自动酶联荧光免疫测试(VIDAS),迅速获得初步结果,阳性反应者需作进一步证实。
EHEC O157:H7检验程序图解
检样25g
↓
mEC225mL → VIDAS快速筛选
↓41±1℃,18-24h
10-4,10-5,10-6稀释度涂布TC-SMAC
↓36±1℃,18-24h
挑取5-10个可疑菌落接种MUG-LST
↓36±1℃,18-24h
MUG阴性培养物转种普通营养琼脂
↓ ↓
生化反应鉴定 血清凝集鉴定
或
胶乳凝集试验
用上述方法在样品中分离获得的纯菌落,经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者,报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。
如需要进一步检测Vero毒素基因的存在,可通过接种Vero细胞或Hela细胞,观察细胞病变进行判定,或可使用基因探针检测和聚合酶链反应(PCR)检测法。(参见FDA细菌分析手册第8版)
表1:EHEC O157:H7部分生化反应特性
靛基质(吲哚)试验
|
阳性
|
MR-VP试验
|
MR阳性 VP阴性
|
枸橼酸盐利用试验
|
阴性
|
氧化酶试验
|
阴性
|
三糖铁琼脂
|
底及斜面黄色,H2S-
|
纤维二糖发酵
|
阴性
|
山梨醇发酵
|
阴性或迟缓发酵
|
赖氨酸脱羧酶
|
阳性(紫色)
|
鸟氨酸脱羧酶
|
阳性(紫色)
|
棉子糖发酵
|
阳性
|
卫矛醇发酵
|
阳性
|
西蒙氏柠檬酸盐
|
阴性
|
鼠李糖发酵
|
阳性
|
MUG试验
|
阴性
|
动力试验
|
有动力或无动力
|
表2: EHEC O157:H7与大肠埃希氏菌有鉴别意义的生化特性
试验项目
|
E.coliO157:H7
(174株)%
|
大肠埃希氏菌
|
(974株)%
|
(1887株)%
|
MUG
|
0
|
96
|
NT
|
山梨醇
|
0
|
95
|
80
|
棉子糖
|
100
|
20
|
49
|
卫矛醇
|
100
|
50
|
49
|
赖氨酸
|
100
|
92
|
81
|
鸟氨酸
|
100
|
74
|
58
|
[注] NT为未检测,表内数字为阳性率。
五、控制
适宜的蒸煮,适当的储存温度,个人卫生教育,防止粪便污染动物胴体是控制出血性大肠杆菌污染的主要措施。
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