弯曲菌属及检验

1.形态与染色

　　本菌为革兰氏染色阴性菌,螺旋形,弯曲杆状,大小为(0.2-0.8)μmX(0.5-5)μm，有一个以上 螺旋并可长达8μm,也可出现S形或似飞翔的海鸥形，菌体一端或二端有单根鞭毛，长度约为菌体的2-3倍，有活泼的动力或不产生动力，超过48小时的培养 物以衰老的球菌状居多。

2.培养特性

　　弯曲杆菌是一类微需氧菌，初次分离时需在含5%氧、85%氮、10%二氧化碳环境中，该菌相对脆弱，对周围环 境敏感，如对干燥、加热、消毒、酸性和21%氧气的空气都敏感。培养适宜温度为25-43℃，最适宜温度为42℃。最适pH7.2。对糖类既不发酵也不氧 化，呼吸代谢无酸性或中性产物。在布氏肉汤中生长呈均匀混浊。在血琼脂上，初分离出现两种菌落特征：第一型菌落不溶血，灰色，扁平，润湿，有光泽，看上去 像水滴，边缘不规则，常沿划线生长；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径1mm-2mm），边缘整齐，半透明，有光泽，中心稍浑，呈单个菌 落生长。

3.生化特性

　　弯曲菌属各个种的生化特性见表一。

表一 弯曲菌属各个种的生化特性

注：＋：90％以上阳性；D：11－89％阳性；－：90％以上阴性 ；〔－〕：一般不生长。

R为耐受，S为敏感。

　　空肠弯曲杆菌感染称为弯曲杆菌病，引起腹泻。据报道，从腹泻患者分离出此菌的分离率大大高于沙门氏菌。研究表 明，该菌少至500个也可致病，但很少发生死亡，死亡率为千分之一。最易感人群是5岁以下儿童和15－29岁的青年。该菌广泛存在于鸟、禽、猫、狗等动物 体内，从牛奶、蟹肉、河水和无症状人群粪便中可分离到此菌。健康的鸡和奶牛携带该菌。弯曲杆菌已涉及生的和未煮熟的鸡、生的和巴氏杀菌不彻底的牛奶、蛋制 品、生火腿、未经氯处理的水。

　　本菌抵抗力不强，易为干燥、直射阳光及弱消毒剂等杀灭，58℃5分钟可杀死。对青霉素、头孢霉素耐受，对红霉素、四环素、庆大霉素敏感。

　　弯曲杆菌在胆管中生长，小肠上端微需氧环境适宜本菌生存和繁殖，造成空肠、回肠和大肠组织损伤，通过肠粘膜侵 入血液。空肠弯曲菌感染的患者，临床表现发热、腹泻、呕吐和肌肉痛。潜伏期平均3－5天，病程7－10天。1－2天后，粪便的特征是带血，镜检中有多形核 白血球，重症病例也有痢疾样血、粘液便，常误诊为急性溃疡性肠炎。该菌感染自然恢复，抗生素能进一步限制感染病人粪便中细菌的存活时间。

1.增菌：

A、碎牛肉

　　称取25g样品,置于匀质杯中,加入100mL增菌肉汤.用匀质器以8000-10000r/min匀质30s。将匀质液通过灭菌纱布,倒入250mL三角瓶中,于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

B、净膛全禽和分割肉

　　在一个灭菌容器中,用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min.肉汤经灭菌纱布过滤,于23000xg、 4℃离心20min,或于16300xg、4℃离心30min,弃去上清液,将沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉汤,摇匀。 于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

C、牛奶

　　称取40g牛奶放入离心管中,按2.条中方法离心.弃去脂肪和上清液将沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉汤,摇匀。于微需氧条件下,35℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

D、贝类

　　将100g样品和100mL增菌肉汤放入均质杯中,用均质器以8000-10000r/min均质30s。用灭菌纱布过滤,取滤液50mL滤液放入500mL三角瓶中,加入200mL增菌肉汤, 于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

E、河水或污水

　　取水样2-4升,每升水样加入5mL1M硫代硫酸钠,用0.45μm微孔滤膜过滤,立即将滤膜置

　　于100mL增菌肉汤中, 于微氧条件下,30℃预增菌3h后,再于37℃增菌2h,然后于42℃培养20-44h。

2.分离和初步鉴定

　　取5mL经20-44h增菌的培养物,以0.65μm孔径滤膜过滤.取经过滤和未经过滤的增菌培养物,分别在 分离用琼脂平板上划线接种,各不少于二个平板.将平皿置于微需氧条件下42℃培养24-48h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色(可能出现浅红色)凸 起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落.挑取典型菌落制作湿片,用相差(或暗视野)显微镜检查,本菌呈快速螺旋运动。涂片作革兰氏染色镜检时,本菌 为革兰氏阴性,如小逗点状,两菌体的末端相连时,呈S形、海鸥形或螺旋状.挑取初步鉴定为弯曲杆菌的菌落,在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上。根据 生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。

3.证实试验

　　从用作纯分离的平板挑选二个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环,分别接种于50mL三角瓶中的4mL 布氏肉汤中,于微需氧条件下42℃培养24-48h.同时接种一份阳性培养物作为对照。通常用于生长试验和生化反应的基础培养物是含0.18%琼脂的布氏 肉汤。该培养基分装于试管中,每管7mL。从所有布氏肉汤中取出接种物,滴加0.2-0.3mL于琼脂表面。

(1).生长温度试验

　　接种3管含0.002%中性红(NR)的基础培养基,其中一管置于37℃培养,检查在这一温度下的生长情况, 并用于观察过氧化氢酶反应。另二管分别置于25和42℃培养。每日检查有无生长。对未生长者,需培养5d方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长仅限于接近培养 基表面的一薄层,广泛的生长不是弯曲杆菌属细菌所致。

(2).过氧化氢酶试验

　　滴加3%过氧化氢溶液于有细菌生长的试管中,产生气泡者为阳性反应。

(3).氧化酶试验

　　使用琼脂平板表面经24h培养的生长物.将氧化酶试剂滴于棉拭子上,用棉拭子接触生长物表面,接触点变为深蓝色者为阳性。

(4).硝酸盐还原试验

　　将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基中,置空气中于37℃培养5d.加入亚硝酸盐检测试剂,出现红色者为阳性反应。

(5).1%甘氨酸中生长试验

　　将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基。置空气中于37℃培养.每日检查有无生长,对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。

(6).3.5%氯化钠中生长试验

　　将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基。置空气中于37℃培养.每日检查有无生长,对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。

(7).硫化氢产生试验

　　将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基,将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部 (不让滤纸条接触培养基),旋紧试管帽。 置空气中于37℃培养.每日检查，观察滤纸条是否变黑，变黑表明有硫化氢产生，为阳性反应。对未出现阳性反应者需培养5d,方可作出最后判断。

（8）.TSI试验

　　接种于TSI斜面，于微需氧条件35－37℃培养5d.空肠弯曲菌不产生硫化氢。所有弯曲杆菌属为碱性/碱性反应。

(9).麦康凯试验

　　将供试培养物接种于麦康凯培养基,于微需氧条件37℃培养3d,记录有无生长。

(10).马尿酸盐水解试验

　　用试管分装马尿酸盐水解培养基,每管0.4mL,冻存备用。将琼脂平板上培养过夜的生长物接种于1%马尿酸溶 液中,振摇后置37℃水浴中放置2h。每管加入0.5mL茚三酮试剂(将3.5g茚三酮溶于100mL1:1丙酮和丁醇中),室温下放置2h,出现紫色者 为阳性反应。

(11).抗生素敏感性试验

　　用灭菌棉拭子将预先准备好的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将头孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圆纸片分别贴于平板表面。于微需氧条件37℃培养24h,检查有无抑菌圈。

　　根据生化鉴定结果表对细菌作出鉴定。

附: 抗生素溶液

　　头孢哌酮钠（Sodium cefoperazone）:称取0.5g,用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存5天。

　　三甲氧卞氨嘧啶乳酸盐:称取0.66g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存1年。

　　万古霉素: 称取0.5g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存2个月。

　　放线菌酮: :称取1.25g, 用乙醇溶解后,用水定容于100mL容量瓶中。该溶液4℃保存1年。

　　每1000mL经灭菌的布氏增菌肉汤中加入以上4种溶液各4 mL。