食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定方法

　　1　主题内容与适用范围

　　本标准规定了各种食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定方法。

　　本标准适用于各种食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定。

　　在薄层板上的最低检出量：黄曲霉毒素B1、G1为0.004µg，B2、G2为0.002?g。本方法的最低检出浓度：黄曲霉毒素B1、G1为5µg/kg，B2、G2为2.5µg/kg。

　　2　引用标准

　　GB/T 5009.22食品中黄曲霉毒素B1的测定方法

　　第一篇　薄层色谱法

　　3　原理

　　样品经提取、浓缩、薄层分离后，在365nm紫外光下，黄曲霉毒素B1、B2产生蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G1、G2产生黄绿色荧光，根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。

　　4　试剂

　　4.1　所用试剂同GB/T 5009.22中3.1～3.13。

　　4.2　次氯酸钠溶液(消毒用)：配制方法见GB/T 5009.22中3.16。

　　4.3　苯-乙醇-水(46+35+19)展开剂：取此比例配制的溶液置于分液漏斗中，振摇5min，静置过夜。将上下层溶液分别置于具塞瓶中保存，上下层交界的溶液弃去不要。若溶液出现混浊，则在80℃水浴上加热，待清晰后，即停止加热，取上层溶液作展开剂用。另取一定量的下层溶液置小皿中，再放于展开槽内。将薄层板放入展开槽内，预先饱和10min后展开。

　　4.4　硫酸(1+3)。

　　4.5　黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液。

　　4.5.1　单一标准溶液(10µg/mL)：准确称取黄曲霉毒素B1、G1标准品各1～1.2mg，黄曲霉毒素B2、G2标准品各0.5～0.6mg，用苯-乙腈混合液作溶剂。配制方法、浓度及纯度的测定参照GB/T 5009.22中3.14。

　　黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的分子量及用苯-乙腈作溶剂时的最大吸收峰的波长及摩尔消光系数见下表。

　　(图略)

　　4.5.2　各标准使用液：以下各标准液均用苯-乙腈混合液配制。

　　4.5.2.1　黄曲霉毒素混合标准使用液I：每毫升相当于0.2µg黄曲霉毒素B1、G1及0.1µg黄曲霉毒素B2、G2，作定位用。

　　4.5.2.2　黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ：每毫升相当于0.04µg黄曲霉毒素B1、G1及0.02µg黄曲霉毒素B2、G2，作最低检出量用。

　　5　仪器

　　同GB/T 5009.22中4.1～4.9。

　　6　分析步骤

　　6.1　取样：同GB/T 5009.22中5.1。

　　6.2　提取：同GB/T 5009.22中5.2。

　　6.3　测定：

　　6.3.1　单向展开法

　　6.3.1.1　薄层板的制备：同GB/T 5009.22中5.3.1.1。

　　6.3.1.2　点样：同GB/T 5009.22中5.3.1.2。滴加式样如下：

　　第一点：10µL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ。

　　第二点：20µL样液。

　　第三点：20µL样液+10µL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ。

　　第四点：20µL样液+10µL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅰ。

　　6.3.1.3　展开与观察：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的比移值依次排列为B1>B2>G1>G2。

　　在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干，再于另一展开槽内加10mL丙酮-三氯甲烷(8+92)，展开10～12cm，取出。在紫外光灯下观察结果，方法如下。

　　6.3.1.3.1　由于样液点上加滴黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅰ或Ⅱ可使黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别与样液中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2依次为0.0004，0.0002，0.0004，0.0002?g，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的最低检出量是否正常出现。如为阳性，则起定位作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2依次为0.002，0.001，0.002，0.001?g，主要起定位作用。

　　6.3.1.3.2　若第二点在与黄曲霉毒素B1、B2的相应位置上无蓝紫色荧光点;或在与黄曲霉毒素G1、G2的相应位置上无黄绿色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1、G1含量在5µg/kg以下;B2、G2含量在2.5µg/kg以下;如在相应位置上有以上荧光点，则需进行确证试验。

　　6.3.1.4　确证试验：

　　6.3.1.4.1　黄曲霉毒素与三氟乙酸反应严生衍生物，只限于B1和G1;B2和G2与三氟乙酸不起反应。B1和G1的衍生物比移值为B1>G1。于薄层板左边依次滴加两个点。

　　第一点：10µL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ。

　　第二点：20µL样液。

　　于以上两点各加三氟乙酸1小滴盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。再于薄层板上滴加以下两个点。

　　第三点：10µL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ。

　　第四点：20µL样液。

　　再展开(同6.3.1.3)，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1或G1标准点相同的衍生物，未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。

　　6.3.1.4.2　黄曲霉毒素B2和G2的确证试验，可用苯-乙醇-水(46+35+19)展开，若标准点与样液点出现重叠，即可确定。

　　6.3.1.4.3　在展开的薄层板上喷以硫酸(1+3)，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2都变为黄色荧光。

　　6.3.1.5　稀释定量：样液中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2荧光点的荧光强度如各与黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准点的最低检出量(B1、G1为0.0004?g，B2、G2为0.0002?g)的荧光强度一致，则样品中黄曲霉毒素B1、G1含量为5µg/kg;B2、G2含量为2.5µg/kg。如样液中任何一种黄曲霉毒素的荧光强度比其最低检出量强，则需逐一进行定量，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。定量与计算方法参照GB/T 5009.22中5.3.1.5与5.3.1.6。

　　6.3.2　双向展开法

　　6.3.2.1　滴加两点法

　　6.3.2.1.1　点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘0.8～1cm处各滴加 10?L黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ，在距左边缘2.8～3.0cm处各滴加20?L样液，然后在第二板的样液点上加滴10µL黄曲霉毒素混合标准使用液 Ⅱ;在第三板上的样液点上加滴10?L黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅰ。

　　6.3.2.1.2　展开：同GB/T 5009.22中5.3.2.1.2。

　　6.3.2.1.3　观察及评定结果：

　　6.3.2.1.3.1　在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，则样品中黄曲霉毒素B1、G1含量在5?g/kg以下;B2、G2的含量在2.5µg/kg以下。

　　6.3.2.1.3.2　若第一板在与第二板的相同位置上各出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置的荧光点是否各与其黄曲霉毒素B1、B2;G1、G2标准点重叠，如果重叠，再按6.3.2.1.3.3进行所需的确证试验。

　　6.3.2.1.3.3　黄曲霉毒素B1、G1的确证试验：取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘0.8～1cm处各滴加10µL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ及1滴三氟乙酸，距左边缘2.8～3cm处，第四板滴加20µL样液及 1滴三氟乙酸;第五板滴加20µL样液、10?L黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ及1滴三氟，乙酸。产生衍生物的步骤及展开方法同GB/T 5009.22中5.3.2.1，观察样液点是否各产生与其黄曲霉毒素B1或G1标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。

　　如样液黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量高时，则将样液稀释后按6.3.1.4作确证试验。

　　稀释定量与计算参照GB/T5009.22中5.3.2.1.5与5.3.2.1.6。

　　6.3.2.2　滴加一点法

　　同GB/T 5009.22中5.3.2.2。所不同处是在薄层上滴加标准液时以黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ代替黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04?g/mL)。稀释定量与计算参照GB/T 5009.22中5.3.2.2与5.3.1.6。

　　第二篇　微柱筛选法

　　7　原理

　　样品提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附，在365nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分离B1、B2、G1、G2，故结果为黄曲霉毒素的总量。

　　8　试剂

　　8.1　石油醚：沸程60～90℃或30～60℃。

　　8.2　中性氧化铝：层析用100～200目。

　　8.3　酸性氧化铝：层析用100～200目。

　　8.4　无水硫酸钠：过40～80目筛或80～100目筛。

　　8.5　硅镁型吸附剂：层析用100～200目。

　　8.6　甲醇水溶液：(55+45)。

　　8.7　展开剂：丙酮-三氯甲烷(1+9)。

　　8.8　脱脂棉：用索氏提取器以二氯甲烷为溶剂提取2h，挥干后贮于瓶中保存。

　　8.9　黄曲霉毒素B1标准液：用苯-乙腈(98+2)配成0.4µg/mL的贮存液及0.1µg/mL的使用液，避光冷藏。

　　注：层析用氧化铝、硅镁型吸附剂、无水硫酸钠应在120℃活化2h，密塞，贮于干燥器内可保存一周。

　　9　仪器

　　9.1　紫外光灯：8～100W，带有波长365nm滤光片。

　　9.2　微柱管：内径0.4cm，长12cm的玻璃管，为加液方便上加一段粗管。

　　9.3　微柱管架。

　　9.4　微量注射器：50mL。

　　10　分析步骤

　　10.1　提取

　　10.1.1　粮食、花生及其制品：取粉碎过筛(20目)样品20.00g于具塞锥形瓶中，加100mL甲醇水溶液，30mL石油醚，密塞振摇 30min，静置片刻，过滤于50mL具塞量筒中，收集50mL甲醇水滤液(注意切勿将石油醚层带入滤液中)，转入分液漏斗中，加50mL硫酸钠溶液 (20g/L)稀释，加三氯甲烷10mL，轻摇2～3min，静置分层，三氯甲烷层通过装有5g无水硫酸钠的小漏斗脱水(以少量脱脂棉球塞住漏斗颈口，并以少量三氯甲烷润湿)，并滤入10mL比色管中，再向分液漏斗中加3mL三氯甲烷重提一次，脱水后滤入原比色管中，以少量三氯甲烷洗漏斗并定容至 10.0mL，混匀，密塞，待测。此样液1mL相当1.0g样品。

　　10.1.2　植物油：称混匀油样10.00g于20mL的烧杯中，用50mL石油醚分数次洗入分液漏斗中，加50mL甲醇水溶液轻摇2～3min，静置分层，将下层甲醇水溶液转入另一分液漏斗中，加50mL硫酸钠水溶液(20g/L)稀释，加三氯甲烷10mL，以下按10.1.1自“轻摇 2～3min”起操作。此样液1mL相当1.0g样品。

　　10.1.3　发酵酒、酱油、醋等水溶性样品：啤酒等含CO2的样品，需在烧杯中于水浴上加热、搅拌、除去气泡，否则易乳化。称混匀样品20.00g于小烧杯中，以80mL硫酸钠溶液(20g/L)洗入分液漏斗中，加三氯甲烷10mL，此样液1mL相当2.0g样品。

　　10.1.4　腐乳、黄酱类：称取混匀样品20.00g于具塞锥形瓶中，加甲醇水溶液100mL，石油醚20mL。振荡30min，静置片刻，以折叠快速定性滤纸过滤于50mL具塞量筒中，收集甲醇水滤液50mL(相当10g样品，因为10g样品中约含有5mL水)，置于分液漏斗中，加入三氯甲烷 10mL，以下按10.1.1自“轻摇2～3min”起操作。此样液1mL相当1.0g样品。

　　10.2　测定

　　10.2.1　微柱管的制备：以少量脱脂棉做底用粗铁丝砸实，置于微柱管架上，依次加入高为0.5cm无水硫酸钠(80～100目)，0.5cm硅镁型吸附剂，0.5cm无水硫酸钠(80～100目)，1.5cm中性氧化铝，1.5cm酸性氧化铝，3cm无水硫酸钠(40～80目)，顶部以少量脱脂棉堵塞，装试剂时管要垂直，每装一种试剂要适当敲紧，两种试剂之间界面要平齐，柱管要随装随用，以免在空气中吸水活性下降。

　　10.2.2　微柱层析：在装好的微柱中，加入三氯甲烷提取液1.0mL，同时做标准管，另取三支微柱管，各加入三氯甲烷1mL，再分别加入黄曲霉毒素B1标准液(0.1?g/mL)0，50，100?L，相当黄曲霉毒素B1标准0，5，10ng，待加液流至顶层时，即加入1mL丙酮-三氯甲烷(1+9)展开剂，在加样或展开时，柱管均要保持垂直，待展开剂流完后，即可观察结果。

　　10.2.3　结果观察与评定：于波长365nm紫外光灯下观察，将层析后的样品管依次与0，5，10ng黄曲霉毒素B1标准管比较，若样品柱管内硅镁型吸附剂层与0管一致则为阴性(在5µg/kg以下)，如样品管中硅镁吸附剂层呈蓝紫色荧光环，则为阳性，并需进一步按薄层层析法进行确证测定，但不需重新提取样品。其操作如下：准确吸取原三氯甲烷提取液4.0mL(相当4g或8g样品)于小蒸发皿内挥干，以少量苯-乙腈混合液 (98+2)分数次转入刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混匀，按薄层层析法确证，并测定黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。

　　附加说明：

　　本标准由卫生部卫生监督司提出。

　　本标准第一篇由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、中华人民共和国青岛进出口商品检验局负责起草;第二篇由北京市卫生防疫站、中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、卫生部食品卫生监督检验所负责起草。

　　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。