PYRO测序用于SNP基因分型

　　其实是一种段片段焦磷酸测序技术，在测序引物的引导下，完成段片段(含snp)的测序，从而实现基因分型。缺点：不能检测长片段，对于重复序列没有办法。

　　原理简介

　　1.测序引物与单链，PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。

　　2.四种dNTP之一被加入反应体系，如与模扳配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。

　　3.ATP sulfurylase在adenosine 5´ phosphosulfate存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化，oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

　　4.TP和未掺入的dNTP由Apyrase降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

　　5.然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使用的是dATPS而非 dATP，因为dATPS不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATPS的催化效率更高。而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。