【求助】巢式PCR

最新回复

• dog002 (2015-8-05 14:55:23)

  巢式PCR和普通PCR在反应原理上是相同的 不同之处在于 巢式PCR第二轮的模板不是全部CDNA 而是第一轮反应后的产物（通常取第一轮反应的1/10作为第二轮反应的模板)
  我做过巢式 放大作用非常明显 外引物扩增跑胶完全见不到条带的情况下 用内引物扩增可以见到明显的条带 但假阳性的可能性也大大提高 操作时要避免交叉污染

• any333 (2015-8-05 14:55:44)

  
  使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。

• u234 (2015-8-05 14:56:05)

  
  我也想请教几个问题。
  第一轮PCR循环次数不能太高吗？我用了40，电泳结果看不出有什么东东。
  第二轮PCR后却让我大失所望，结果特异的条带非常不明显，托尾现象及其严重。见图为退火温度梯度的PCR，不论退火温度的高低，特异条带都不明显。
  各位能帮忙分析一下影响因素吗？多谢了！

  
  37065096.jpg

• caihong (2015-8-05 14:56:39)

  
  我也想请教几个问题。
  第一轮PCR循环次数不能太高吗？我用了40，电泳结果看不出有什么东东。
  第二轮PCR后却让我大失所望，结果特异的条带非常不明显，托尾现象及其严重。见图为退火温度梯度的PCR，不论退火温度的高低，特异条带都不明显。
  各位能帮忙分析一下影响因素吗？多谢了！

• TAT (2015-8-05 14:58:58)

  
  DNAgirl你的问题我之前也遇到过，无论怎样优化都一样，总是有大量的smear，做了两个月都没有结果，一度认为是引物的问题。今年开年很快就做出结果了。我觉得操作是很重要的。
  1一定要在冰上加样，直接用冰块比用冰盒好
  2在混合物分到各管前一定要用枪吹打混匀（这步尤其重要）只是用flash甩是不够的，好像酶比较重都沉到管底了
  3适当延长退火时间，我p的片断四百多，用了1min
  4延伸时间也可以延长，我用了1。5min
  5直接把第一轮产物取1ul作为第二轮模板
  6第一轮产物跑电泳可能什么都看不到
  我的小小经验，别气馁，祝你好运了！

• caihong (2015-8-05 14:59:52)

  但是你说的某些我都注意到了，PCR 我是在冰上做的；
  分装时确实也是用枪反复吹打的，
  只是退火用了40s；延伸用了1min；
  第二轮的模板加了0.5ul，不过我想这个是与第一轮的产物量有关，因此我也做了一个模板浓度梯度，但是都是稀释第一轮的产物来用的，难道是我的模板太低了？我会再试！
  第一轮PCR 确实什么都没有。
  我已经试了很多很多边了，结果使我不得不怀疑到引物，想重新设计了。依你的经验，重新燃起了希望之火，我决定再试试！
  希望能跟你一直交流，呵呵！

• caihong (2015-8-05 15:00:20)

  到现在为止，重复了很多次。第二轮PCR结果仍然特异性不明显，但预计四百多的条带还是有的，疑惑的是每个样品都有一条两百左右的带，难道是特异扩增，引物还是有问题吗？见图。我又设计了第三对PCR引物，以第二轮PCR产物为模板，结果还是如此啊！！请指教。多谢！

  
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• gogo (2015-8-05 15:01:14)

  
  也可能是网上公布的序列有问题，只能多设计几个引物，来试了，不得不辛苦了。

• shenkunjie (2015-8-05 15:01:31)

  可能是引物的问题，再检查并对引物进行blast一下。做PCR的时侯还应该注意不要交叉污染了。

• dog002 (2015-8-05 15:02:17)

  
  我用巢式PCR第一轮扩增1300bp的片段，得到很好的结果。经验是如果特异性不好，就大幅度降低Tag酶和引物的量，另外一定要在冰上操作。
  希望对你有帮助。

• caihong (2015-8-05 15:03:05)

  
  谢谢大家的宝贵意见。现在我用第一次PCR产物稀释50倍为末板进行第二次扩增。程序就参照taro的建议, 增加了退火时间,延长了延伸温度. 结果果然好的结果出现了,至少比之前的好很多.

• vvmmoy (2015-8-05 15:03:32)

  
  Van Orsouw, N.J., Zhang, X., Wei, J.Y., Johns, D.R. and Vijg, J. (1998) Mutational scanning of mitochondrial DNA by two-dimensional electrophoresis. Genomics, 52, 27-36.

• xevin (2015-8-05 15:03:53)

  
  DNAgirl ,我现在正在做5‘-RACE，也遇到了你所贴的电泳图中的情况，怎么办都解决不了！，你的情况是怎么解决的阿？谢谢！我的信箱是：sbwan.cau@eyou.com
  谢谢，望各位大侠能多多指点！

• caihong (2015-8-05 15:04:34)

  我后来降低了模板的浓度，稀释了成原来的50倍。退火的时间延长到一分钟。条带就特异了。但是我想还是跟最初的模板有关系，因为我是取的DNA经酶切后的连接产物。也很奇怪啊，现在我换了另外几个样品，又出现了原来的情况。极度不解中啊－－，我想应该是模板的问题。不管怎样，我们遇到磕磕碰碰都不能放弃啊，放弃就等于以前的努力都白费了。呵呵，之前将近两个月的重复几乎使我崩掉呢，后来taro还有其他战友的指导建议，我还是不停的重复，也有几个样品成功了。
  祝你好运

• xevin (2015-8-05 15:05:08)

  ,谢谢你的建议与支持！降低模板浓度，延长退火时间我都试过了，可效果不佳，那还真可能是最初的模板的问题，我会再做一次翻转录的。我想我们所有的战友也都会相互支持着将试验进行到底！
  去年年底我做3‘的时候也遇到了这个情况，现在我重新换了模板、翻转录酶结果3’很容易出来了。但5‘的产物无论如何就是弥散或者是什么也没有，但用5’－cDNA扩3‘的片段却是很容易就出来了，可能什么原因呢？望大家指点！

• am10 (2015-8-05 15:16:33)

  
  套式引物（Nested Primer）PCR
  用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞AS52的分子突变。AS52细胞含有单拷贝的细胞gpt（guanine phos－phribosy transferase）基因，与哺乳动物具有同源性。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶DNA的扩增是非常有效的。
  若将套式PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（至25～30bp），同进缩短内引物长度（15～17bp），使外引物先在高温退火温度下做双温循环扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上作低温火温度的三温循环直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入，两种循环一气呵成，等于只做一次PCR，而灵敏度与套式二次PCR无异，在我们最近推出的PTC 51气流式DNA热循环仪上就可以完成全部程序。
  套式一次PCR的成功，使PCR检测的全过程可以在5h内完成，使当天出检验报告成为现实，也使PCR检测走入临床有了现实的基础

• DCS (2015-8-05 15:16:52)

  使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。
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  第一轮15-20个循环可以扩增出目的片段吗？你做的体系是10ul还是15ul的呢？求解答哦，谢谢你

• DCS (2015-8-05 15:17:26)

  套式引物（Nested Primer）PCR
  用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DN***段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞AS52的分子突变。AS52细胞含有单拷贝的细胞gpt（guanine phos－phribosy transferase）基因，与哺乳动物具有同源性。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶DNA的扩增是非常有效的。
  若将套式PCR的内外引物稍加改变，延长外引物长度（至25～30bp），同进缩短内引物长度（15～17bp），使外引物先在高温退火温度下做双温循环扩增，然后改换至三温循环，使内引物在外引物扩增的基础上作低温火温度的三温循环直到扩增完成，这样就可以使两套引物一次同时加入，两种循环一气呵成，等于只做一次PCR，而灵敏度与套式二次PCR无异，在我们最近推出的PTC 51气流式DNA热循环仪上就可以完成全部程序。
  套式一次PCR的成功，使PCR检测的全过程可以在5h内完成，使当天出检验报告成为现实，也使PCR检测走入临床有了现实的基础
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  大侠，求巢式PCR一次做的具体实验步骤，可以吗？我好感兴趣呐。或者你有相关的好文献能不能分享一下，谢谢了