【求助】请问引物2聚体大约是多少BP？

最新回复

• 12xunmei (2015-12-31 15:42:28)

  
  同问这个问题，
  我的目的也这么大，
  听说用热启动可以避免一下。但很多时候都很难确定的。
  欢迎高手进入

• misswu61 (2015-12-31 15:42:49)

  
  楼上的2位朋友，你们这么小的片段为什么不交给公司合成呢？多不了多少钱的。而且可以合成4个OD，绝对够用了！
  引物二聚体就只有几十个bp，跑胶时别忘了加marker就行了嘛。

• xue258 (2015-12-31 15:43:08)

  
  我想做RT的半定量，公司合成没用的。用了MARKER，也不太好区别呀，感觉又象带又象引物2具体。各位高手，大家来讨论一下，遇到这种情况有什么好的解决方法呢？

• 3.14 (2015-12-31 15:43:29)

  
  2聚体大概都是在100bp位置的模糊带，和你的98应该是挺难区分的。

• zhenxin (2015-12-31 15:43:45)

  
  的确很难区分，减少引物的量可以一定程度上减少引物二聚体！

• 莲花白 (2015-12-31 15:44:24)

  
  的确很难区分，减少引物的量可以一定程度上减少引物二聚体！

• yayya (2015-12-31 15:51:04)

  100bp左右，
  消除的方法：
  1.提高退火温度，可高至65度。
  2.减少引物用量，如50ul 体系只用0.25ul（20uM）！
  3.减少循环数，< 30.
  4.ｄNTP用量减半。
  当然，如果因物本身设计不合理的话，这些改进的意义就不会太大，这其中退火温度的影响最大！

• wawa (2015-12-31 15:55:56)

  
  引物二聚体一般是60--70bp
  你可以稀释引物，来减少二聚体的形成

• loli (2015-12-31 15:56:17)

  
  一般是几十至一百BP左右，电泳条带模糊，如果条件允许的话，可以通过测序来区分引物带和目的条带
  想减少引物二聚体，可以这样实验一下：在配PCR反应液的时候，在冰上操作，开机预热PCR仪，所有准备好之后，再加引物对，这样可有效减少杂带及引物带的形成

• okhaha (2015-12-31 15:56:37)

  引物二聚体的大小是80bp左右，你的片断和我的差不多大小，我的是100bp，我前几天就为怎么区分而苦恼，所以我作了个总结。你看看，呵呵，合成也是一个办法，不过加上酶切什么的，花费会高些，但是我重在学技术，所以自己扩，你要赶时间就合成吧
  2．  DXY上的建议：
  1．  可以用非变性PAGE胶电泳，应该能分开的，理论上说分辨率达到1个碱基。可以用非变性丙烯酰胺凝胶电泳进行分离鉴定Big SmileNA在丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围:
  丙烯酰胺(W/V):12% 有效分离范围(bp):40-200
  15% 25-150
  电压一般是1-8V/cm, 6个小时后银染即可分辨你的两个片段
  2．  可以用1.3%TAE的长胶，在30伏的电压下（中号电泳槽），跑16-20小时是应该可以分开的。
  3．  用2.5%的琼脂糖就能分开，我们实验室经常用它来分开相差28bp的片段，效果很好，看的很清楚，但有几点要注意，缓冲液要是新配的，电压100v跑10分钟，接着50v跑一个 半小时，到两个小时。
  4．  理论上用1.5或者2.5琼脂糖应该都可以分开，在电泳的时候电压不适宜太大，用40-50v跑上2小时左右应该就可以了。电压加大到80v或者100v的时候虽然节省实验时间，但是有时条带的效果看起来就不是很好。还有就是似乎你的Marker选择的不好，即使电泳能够分开两条带，这个Marker也很难来说明你的目的条带和内参带的大小。
  5．  用聚丙烯酰胺跑垂直电泳。
  1。需要单独的垂直电泳槽，及配置聚丙烯酰胺凝胶。
  2，具体的做法可以到 生物谷 网站，有详细的说明。
  3，你可以用5%的琼脂糖跑一下。
    建议你跑PCR的时候做个阴性对照，只加引物，电泳时看阴性对照引物二聚体的位置，以区分拟订目的片段71bp条带，或是电泳时直接加一空引物做对照
  ．  若是非特异扩增的小片段条带
    可以引物浓度不变，升高一下褪火温度。设计一个引物浓度梯度，接着降引物浓度 。
    除了做引物浓度梯度，可以降低一下Mg离子浓度，或者干脆做一个镁离子浓度梯度，降低退火温度肯定是非特异产物更多的 。引物二聚体的出现是相对的，并不是单纯因为你的条件而导致二聚体的出现，事实上如果引物更倾向于和目的片断结合，正常pcr扩增的话，那引物二聚体就基本不会出现了，换句话说，如果你能扩增出目的条带，那么同样的条件，撤去模板，进行pcr循环就有可能出现引物二聚体。引物二聚体的出现并不可怕，只是说明你的引物不是最佳，但不直接决定能否扩增出来，通常只要引物和目的片断有一定的配对区，摸索合适的pcr条件，应该是能扩增出来的。
    单纯依靠降低退火温度，不能解决这一问题，反而会增加非特异扩增的机会。建议你先摸索一下退火温度，提高退火温度常可解决问题。从你的条带位置看，不像是二聚体，到像是非特异扩增的条带，很可能引物设计的不好，还有另一位置扩增效率更高，因为条带短，更容易扩增出来。另外，你用的引物浓度也太高了。正常情况下，终浓度0.1-1uM。
    电泳都是引物二聚体，内参是GAPDH，原因可能是模板量太少，1.RNA抽提的问题。抽完RNA后应立即测一下纯度。可以用紫外分光光度仪或甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计算A260/A/280值，如果在1.6-1.8之间，表明纯度较好，低于辞职说明有蛋白污染，高于此值说明可能有RNA降解。琼脂糖电泳可以大致的估计一下 看三条带的亮度，28S〉18S〉5.8S。2.RT没做成功。关于逆转录的反应体系的影响因素都要考虑进去，为了防止RNA被痕量的RNase 降解，一般还应加入RNase抑制剂。3.如果RT没问题，就加大模板的量再扩扩试试。
    其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。