【求助】RT-PCR结果处理

最新回复

• seagate (2016-1-06 15:22:09)

  
  什么是ct值？

• moonlight (2016-1-06 15:22:27)

  
  问题不明确，不同的实验目的数据处理方式不同。
  做绝对定量？相对定量？SNP？
  Ct值只是辅助分析的一种手段，根据不同的实验目的有不同的应用。

• guagua (2016-1-06 15:22:43)

  
  各位前辈，大家好！我是初学者，最近做了几次PCR，先用正常的细胞提出来的RNA摸条件，结果上次用的是55度退火，目的带和内参都很亮，但其下也有一片模糊的背景，后来我大批量的做了一次条件没变，结果内参还行，目的带根本没有，不过后来的这次我把体系减半了，原来PCR是40微升的体系，这次减为20微升了，引物各加的0.25微升，是不是我的引物太少了？另外我买的是TAKARA的两步法试剂盒说明书上RT是10微升体系而PCR是40微升体系是不是太多了，而且说第二步是把PCR反应液加到RT产物里这样跟一步法基本上不就一样了吗？还有就是我的片断才一百多个bp，条件该怎么设啊？既然上次出结果了是不是就可以排除引物的问题了？急盼各位指点迷津，谢谢！！！

• toy (2016-1-06 15:22:57)

  
  温度提高一度呢？是不是引物设计的不太好？

• 莲花白 (2016-1-06 15:23:13)

  
  实时PCR最终结果是每个样品对应的Ct值（即每个反应管内开始指数扩增时对应的循环数）。将其进行如下处理，即可获得基因表达差异倍数：
  (1)通过实时荧光曲线得到目标基因和看家基因的Ct值，
  (2)均一化校准，计算出同一个样品中目标基因与内标基因Ct值的差值，
  即△Ct=Ct目标基因－Ct内标基因，
  (3)计算出经过处理的样品与未处理样品间（如不同时间处理间或不同组织间) △Ct值的差值，即△△Ctn= △Ctn-△Ct0，
  (4)计算基因差异表达的倍数＝2－△△Ct，即目的基因在经过处理的样品中的表达是未处理样品的2－△△Ct倍。

• yhz1973 (2016-1-06 15:23:28)

  但我觉得既然上次能跑出带来就应该不是引物的问题吧，我这次还按减半做的根本就没带，把引物提高到了0.5微升，循环数提高到了40也不行，我想要不还按说明书上的40微升的做，但我就觉得这样太浪费了，不知道可不可以按一般的rt-pcr两步法来做，总觉得这样太浪费了，把pcr反应液全加到rt产物里有这样做得吗？那位买的takara的试剂盒啊？可不可以给我分享一点经验啊，谢谢了

• hyuu (2016-1-06 15:23:55)

  
  我们用的是Takara的盒子，可是，不明白在问什么问题。或者做的不一样？
  我们做20ul的体系，引物加1ul（nmol数溶10倍，然后再稀释20倍），real-time一般是45个循环

• woshi (2016-1-06 15:25:04)

  
  Takara提供的说明书上PCR反应体系是40ul的，RT反应体系是10ul的，你是按照Takara的说明书做的吗？说明书上是说把PCR反应液加入到RT产物里，就是说这次的RT产物要全部用上，一般他们两步法不是取出多少cDNA再加上别的一块反应吗？我上次就按照说明书做的目的带和内参都出来了，但有拖带，这次还是按照上次的体系和条件作的结果目的带不清楚了而且还有杂带，请各位大侠帮帮我吧，我是初次做PCR，希望得到各位高手的指点，谢谢！！！

• woshi (2016-1-06 15:25:22)

  
  Takara的PCR反应体系：5乘PCRbuffer 10ul，灭菌蒸馏水28.75ul，Taq酶0.25ul，上下游引物各0.5ul，Total 40ul，我是按照这个做的，RT也是根据说明书上体系做的，上次结果出来了，这次目的带不清楚而且也有杂带，请位大侠帮忙分析一下吧，我下一步该怎么办啊，多谢了！！！

• join (2016-1-06 15:25:34)

  
  使用了试剂盒还有拖带或是杂带出现，说明PCR扩增的特异性非常低，最有可能的就是你引物设计出了问题，估计有错配发生而且效率非常高导致了这种情况。
  一般做qPCR10微升的总体系就足够了，完全不需要象试剂盒上说的40微升体系，反正说明书尽可能让你多用么，然后用完再买么，呵呵。逆转录出来的RT产物我一般是稀释10倍用，比如20微升的逆转录体系，完成后用TE稀释到200微升总体积，用的时候每10微升体系取0.3微升稀释后的cDNA。顺便说下，我不赞成做qPCR用试剂盒，这样会让人产生惰性，出问题了也不好进行分析。

• woshi (2016-1-06 15:25:54)

  
  谢谢楼上的大侠，另外我还想问问，因为我有一次跑出的电泳结果目的带和内参都出来了，但就是有拖带也说明是引物的问题吗?可为什么后来做了几次内参还好不过目的带不清楚还有杂带不知道什么原因呢，如何排除是引物的问题呢？谢谢!!!

• woshi (2016-1-06 15:26:11)

  我上次做的PCR结果挺好的，可这次怎么就不行了呢，感觉一片拖带，想出带又没出的那种，总共五组，三个内参挺好，另外两个没带，目的带就根本没有，这次提的RNA跟上次做的不是一批的，不会是RNA的问题吧？是不是RNA浓度太稀了？上次是一瓶最后用25微升DEPC溶解的，这次24孔板提出三个孔为一组最后加了12微升DEPC，另外跟模板有关吗？我真的很迷茫，不知道该怎么办了，希望好心人赶紧帮帮我这个迷路人，感激涕零！！！

• 盼盼 (2016-1-06 15:26:23)

  
  定量PCR分析软件？ 做定量pcr不是机器自带的么？？！！
  我这里有两个介绍分析Ct的方法，拿来分享分享 嘎嘎
  啊 还有一个是ABI的 个人觉得更好，不过太大了 放不下，要的话问我来吧~ Smile

• 盼盼 (2016-1-06 15:26:42)

  
  啊 突然想起来ABI的有网上的链接
  cuturl('http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_040980.pdf')
  觉得很好