“一体两型三化”——多糖类手性柱的美好时代

“一体两型三化”——多糖类手性柱的美好时代

引：手性色谱技术，作为最重要的手性分析方法之一，不仅可以快速地分析对映体纯度（ee值或者de值测定），而且也可以用于光学异构体的大量制备拆分（Preparative enantioseparation）。开发手性识别能力强、适用范围广、高效的手性固定相（Chiral Stationary Phases，CSPs）是手性色谱技术的关键和核心，亦是共性技术。在诸多被开发出来的手性固定相中，多糖衍生物手性固定相因其适用范围广、载样量大等优点而被视为最具发展潜力的一类手性固定相。以直链淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（多糖衍生物正相手性柱CHIRALPAK AD/CHIRALPAK AD-H/ CHIRALPAK AD-3/ CHIRALPAK IA）为例，本文总结了近年来多糖类及其衍生物手性固定相的开发应用新进展。

关键词：polysaccharide-based chiral stationary phases；多糖衍生物手性固定相；CHIRALPAK AD；CHIRALPAK IA

多糖衍生物，特别是直链淀粉、纤维素的衍生物作为手性选择子，在色谱分离（HPLC & SFC）领域得到了非常深入而细致的应用研究。到目前为止，已有许多多糖类手性固定相被商品化，就当前新近开发应用特征而言，六字诀——“一体两型三化”。即：一体，手性选择子为多糖体（多糖衍生物）；两型，制备方法分物理涂敷型和化学键合型；三化，分析微型化，制备规模化（工业化），应用绿色化（chiral SFC & chiral SMB）。

“一体”：手性选择子为多糖体（多糖衍生物）

多糖类手性材料研究，可以追溯到上个世纪50年代初期，M. Kotake等采用纸色谱法，将纤维素和直链淀粉添加到展开剂中来分离氨基酸。（纸色谱法拆分氨基酸，文章发在令人仰望的JACS上，<Resolution into Optical Isomers of Some Amino Acids by Paper Chromatography  M. Kotake, T. Sakan, N. Nakamura, S. Senoh. J. Am. Chem. Soc., 1951, 73 (6), pp 2973–2974 DOI: 10.1021/ja01150a548>，现在看来有点不可思议！从一个侧面说明科技的突飞猛进。题外话）但由于天然纤维素和直链淀粉因溶解性不好，分离能力不高，应用受到限制。沉寂了大约20年后，G. Hesse and R. Hagel在1973年首先制备了微晶纤维素三乙酸酯（CTA）。当微晶纤维素三乙酸酯溶解于溶剂并涂敷在硅胶上时，第一个被研究的纤维素衍生物手性分离材料就这样神奇地诞生了。后来，名古屋大学冈本佳男（Yoshio Okamoto）教授等人开发的多糖衍生物类手性固定相发展成为相当有用的分离工具。纤维素是葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接成的线性聚合物，而淀粉则是α-1,4-葡萄糖苷连接的螺旋结构。对多糖进行化学衍生不仅可以增加多糖手性识别位点，如酰胺、酯、不同官能团取代的苯基等，也能在多糖表面形成手性空穴，提高多糖的手性识别能力。将这些多糖衍生物涂敷在硅胶表面上就得到了涂敷型多糖手性填料。衍生化多糖的官能团、聚合物平均分子量及其分布、涂敷用的溶剂类型、硅胶孔径等对多糖手性填料的拆分能力均有影响。比如，对于苯基氨基甲酸酯衍生多糖类手性固定相而言，苯环上取代基的性质、数目及位置对CSP的拆分能力均有影响。新型手性选择子纤维素-三(氯代甲基苯基氨基甲酸酯)的苯基部分包含吸电子的氯和供电子的甲基，在某些情况下这种固定相的手性识别能力优于Chiralpak AD柱，可以互为补充。

一句话，多糖体手性填料是一类手性拆分能力强、柱容量大、应用范围广、使用最普遍的手性填料之一，已有许多商品化多糖手性柱出售（做广告咯，Daicel、Kromasil、Macherey-Nagel、Phenomenex、Regis等都有售！）。

“两型”：制备方法分物理涂敷型和化学键合型

多糖体手性选择子，化身为多糖类手性柱，需要经历一个加工成型的过程。当前，已经规模化的、技术成熟的多糖衍生物手性固定相制备方法主要有两种：涂敷法和键合法。不同的键合或交联方法是目前研究的热点，比如（非）区域选择性键合法、共聚-交联法、整体成球法等。

涂敷法，即将多糖衍生物溶解于合适的有机溶剂(称为涂敷溶剂，例如以二氯甲烷、氯仿等作为涂敷溶剂) ，再加入硅胶载体，充分吸附多糖衍生物，然后采用减压蒸发溶剂法除去涂敷溶剂，使多糖衍生物析出并附着在硅胶表面而制备成适用于液相色谱的涂敷型手性固定相（coated CSPs）。这种方法主要是依靠多糖衍生物与硅胶担体之间的氢键作用而将其固定在硅胶表面，这种相互作用力相对较弱，一些能溶解多糖衍生物的溶剂，如二氯甲烷、乙酸乙酯以及四氢呋喃等都不能用作流动相，因此只能用非极性烷烃和醇作为流动相。为了克服涂敷型多糖衍生物在某些溶剂当中会溶胀或溶解的缺点，人们想方设法寻求限制下的突破，将多糖衍生物键合到硅胶表面，开发了各种键合方法，以扩大流动相使用范围。

键合法，多糖衍生物，通过化学反应键合于硅胶或其他载体表面，相互交联成网状聚合物而形成键合型手性固定相（Immobilized CSPs/Covalently bonded chiral stationary phase）。因此，键合的多糖衍生物手性固定相比同类型的涂敷型手性固定相，在流动相选择方面范围更广泛，比如可以用四氢呋喃或二氯甲烷等作流动相。但在手性柱使用过程中，我们发现键合型CSPs与涂敷型CSPs在分离某些化合物时会有区别，这主要是因为键合型CSPs在制备过程中一定程度上破坏了多糖的空间排列，而这种结构可能有利于增强其手性识别能力。虽然键合型CSPs拆分能力没有涂敷型高，但其柱效、稳定性、耐溶剂性能等都高于涂敷型，而因键合方式所致的手性识别能力降低由扩大流动相的选择范围来弥补。所以，键合型多糖手性固定相自2004年上市以来逐渐得到了广泛的应用。

我们知道，涂敷型多糖类手性固定相在正己烷-无水乙醇和正己烷-异丙醇的正相流动相体系中稳定性好，可拆分各类手性化合物。但由于许多手性物质在正己烷-醇的流动相体系中溶解性差，限制了这类固定相在制备型拆分中的应用。键合法则可提高固定相的耐溶剂性能，虽然固定相的手性识别能力略有降低。“寸有所长，尺有所短”，涂敷型固定相有流动相选择范围小的缺点，而键合型固定相则有拆分能力稍降低的短板。基于此，多糖衍生物手性固定相的发展，“一大理想”：保持固定相的手性识别能力的同时，提高固定相的耐溶剂性能！若能在提高固定相的手性识别能力的同时，改善提高固定相的耐溶剂性能，那就更完美了。有理想，就得努力去实现！“两大策略”：一方面，采用涂敷法，开发适用范围更广的新型多糖体手性选择子，进一步提高固定相的手性识别能力，拓展其应用范围；另一方面，采用键合法，发展新的键合方法，改善多糖衍生物耐溶剂性能的同时，保持甚至提高固定相的手性识别能力。这与我们大家熟悉的反相液相色谱有些许类似，比如在做RP-HPLC方法开发时，一方面可以优化流动相体系，另一方面也可以选用不同的C18柱（优化色谱柱）。说到这里，不能不提一下大赛璐（Daicel）公司，键合型手性柱Chiralpak IA、Chiralpak IB、Chiralpak IC和新型手性选择子涂敷型手性柱Chiralpak AY-H、Chiralcel OZ-H的推出上市，这简直就是“一大理想，两大策略”的完美体现。Daicel 公司采用交联-共聚法等键合专利技术制备多糖体手性填料，在提高固定相的耐溶剂性能、拓宽流动相的使用范围的同时，保持了固定相的手性识别能力。目前，这类技术已被采用并有商品化手性柱上市。

“三化”：分析微型化，制备规模化（工业化），应用绿色化（chiral SFC & chiral SMB）

我们知道，液相色谱分离领域已跨入超高效液相色谱（UPLC）的崭新时代，追求更高分离效率、更快分离速度是色谱技术发展的主旋律。根据色谱速率理论（范特姆特方程Van Deemter），粒径越小，柱效越高。减小粒径是提高分离效率和分离速度的一种有效手段，小颗粒填料技术催生了超高效液相色谱的诞生。同样地，手性填料自然也不甘落后，以多糖类手性柱Chiralpak AD为例，从最初的20 µm （制备型分离用）→ 10 µm → 5 µm→ 3 µm，商品化的手性柱Chiralpak AD → Chiralpak AD-H → Chiralpak AD-3，填料颗粒逐步亚微米化，使得3微米填料正在成为业界的新宠。使用亚微米的填料，在提高色谱分离能力的同时减少了溶剂的用量。另一方面，医药工业中手性药物的发展强烈需求规模化制备方法。化学合成（拆分）法、生物催化法、制备色谱法等都是最常用的获得光学纯物质的方法。化学合成法，具有广泛的工业化前景，但存在立体选择性不够高，反应收率较低的问题，特别是不对称合成反应，不能同时获得两种构型的光学异构体（以含1个手性中心的化合物为例），规模化生产尚有许多问题需要解决；而生物催化法虽然光学收率较高，但有机溶剂和水的消耗量大，后处理复杂，生产效率较低等。手性制备色谱法是获取光学异构体最简便快捷的方法，尤其在药物发现阶段大有用武之地！

当今，“低碳环保”已经渗透到我们生活的方方面面，那么手性药物的规模化制备方法如何“绿色”呢？超临界流体色谱法和模拟移动床技术在手性药物大规模拆分中的应用，就体现出绿色环保的理念：超临界流体色谱法SFC，道法自然，采用天然“绿色”的超临界流体CO₂作为溶剂，无需有机溶剂回收处理，省事经济环保，节能降耗又可持续使用，因而SFC对手性药物制备拆分具有独特的吸引力。模拟移动床技术（Simulated Moving Bed Chromatography，SMB），已成功地制备出大量手性化合物的光学纯对映体。虽然由于技术保密的原因，仅有少部分在期刊文献中报导，然而窥斑知豹，足以显示出这项新技术对手性药物发展的重要性。最近的发展更是出现这样一种趋势，在多糖类手性固定相上，采用单一溶剂流动相体系（大多数情况下为醇类，极性有机相分离模式），可以得到很高的产率，且溶剂可循环利用。

题外话

说到手性技术，不管是不对称催化还是手性色谱技术，我们的邻居泥轰国都值得我们琢磨琢磨：不对称催化（野依良治Ryoji Noyori，2001年诺贝尔化学奖获得者）；手性分离材料开发（冈本佳男Yoshio Okamoto，2006年诺贝尔化学奖提名）。庆幸的是，国内的中科院系统、高等院校有不少从事这方面研究的，出了不少文章，但转化成现实还有距离，需要持续的努力，路漫漫，人盼盼。。