在线样品浓缩毛细管区带电泳分析毛发中的苯丙胺类毒品

上一篇 / 下一篇 2010-07-03 14:38:44

　苯丙胺类兴奋剂是近期滥用的毒品。在这类毒品中，苯丙胺、甲基苯丙胺、亚甲基二氧基苯丙胺(MDA)和亚甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA)滥用得更普遍[1]。苯丙胺类毒品的滥用引起的健康和社会问题已经引起了国际社会的广泛关注，同时促进了用于监控滥用行为的各种分析方法的研究。

　　通过毛发监测毒品的滥用具有许多优势，如样品易于收集，并可在室温下长期保存;最重要的是，它可以检测出长达数月的毒品，被称作长期毒品使用的记录带;而且毛发中的毒品浓度与毒品的摄入量具有关联性。近几年，许多研究者研究了长期吸毒者的毛发样品。研究的毒品种类有鸦片、卡可因、大麻、苯丙胺类等等[2～8]。到目前为止，气相色谱质谱法仍然是毛发分析使用最多的一种方法[1，5，9]。该方法灵敏度高、选择性好，质谱的鉴定能力强。在多数情况下，这种方法可以检测到浓度为0.5～1.0 μg/g的毛发，满足长期使用者的监测灵敏度。由于毛细管电泳(CE)分离效率高，且易于操作，运行成本低廉，已经成功地用于缴获毒品和生物检材中的毒品分析[10]。但是将CE用于毛发分析仍然受到很多限制。特别是当采用UV在线检测时，由于毛细管本身光程的限制和进样量的限制，使得检测的灵敏度很低。而在毛发中毒品和毒品代谢物的浓度一般很低(一般为1 μg/g毛发)。根据文献报道，采用区带毛细管电泳CZE)或胶束电动毛细管色谱(MECC)，最低检测浓度约为1 mg/L，显然这一灵敏度不能满足毛发中的毒品分析。

　　文献报道，通过在线浓缩技术提高CZE或胶束电动毛细管色谱(MECC)的检测灵敏度，例如场放大样品堆积技术(fieldamplified sample stacking, FASS)[11～13]。这一方法依据样品溶液与缓冲液的电导率不一致实现样品的在线富集。分析前毛细管首先用高电导的缓冲液冲洗并充满毛细管;之后进入一小段水柱，然后以电迁移方式进入低电导的样品溶液。样品溶液的电导率低于缓冲液的电导率，则在毛细管中的样品段形成高的电场，使被分析的组分在样品溶液中和水柱中的迁移速率高于在缓冲液中的速率。因此，在水柱与缓冲液的交界处形成一个狭窄的浓缩的组分带。可显著提高检测的灵敏度。本研究建立了在线场放大样品堆积(FASS)的CZE电泳技术，对苯丙胺、甲基苯丙胺、MDA、MDMA 4种毒品进行了分离和定量测定，检测的灵敏度提高了1000倍，对于标准品的检出限可达到0.06 μg/L。用本方法对添加毒品的毛发进行提取和测定，可检测到添加浓度1 μg/g的毛发。因此，本方法可用于该类滥用毒品的毛发分析。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器、试剂与样品

　　毛细管电泳分析在贝克曼库尔特公司生产的配有二级管阵列检测器的毛细管电泳仪(P/ACE MDQ)中完成。使用的毛细管为未涂层的熔融硅胶毛细管(polymicro technologies, phoenix, AZ)：总长50.2 cm,有效柱长40 cm, 柱内径73 μm 。分析中毛细管温度为20℃;定量检测波长为200 nm。苯丙胺(Am)、甲基苯丙胺(MAm)、3，4亚甲基二氧基苯丙胺(MDA)和3，4亚甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA)等购于 Cerilliant (Round Rock,TX);毛细管电泳分析内标，苯乙胺(Fisher公司);实验中使用的NaH2PO4、甲醇、NaOH、HCl、H3PO4均为分析纯试剂。

　　2.2 毛细管预处理

　　毛细管在使用前分别用1 mol/L NaOH (30 min)、蒸馏水(30 min)、缓冲液(30 min)在174 kPa压力下冲洗;两次分析之间，用0.1 mol/L NaOH (2 min)、蒸馏水(1 min)、缓冲液(3 min)冲洗;分析结束前，用1 mol/L NaOH (1 min)、蒸馏水(5 min)冲洗，最后空气干燥3 min。

　　2.3 在线浓缩毛细管区带电泳(CZE)分析过程

　　分析用二元缓冲液由含体积40%乙烯乙二醇和100 mmol/L磷酸盐水溶液组成，用4 mol/L H3PO4调整至pH 2.5(pH计，贝克曼公司)，使用前用0.45 μm过滤膜过滤(日本Millex公司);样品溶液由含80%异丙醇的0.1 mmol/L H3PO4溶液制备。

　　两次分析之间采用反向冲洗，即在检测器端施加139 kPa压力，依次用0.1 mol/L NaOH(2 min)，水(1 min)、缓冲液(3 min)冲洗。冲洗后，首先将毛细管两端至于蒸馏水中，等待6 s,然后在进口端施加3.5 KPa压力，压入水柱3 s;之后将毛细管进口端置于样品池中，10 kV 下进样99 s;最后在进样端施加20 kV电压正向分离。

　　3 结果与讨论

　　3.1 FASSCZE与常规CZE分析结果比较

　　图1为浓度5 μg/L的标准品与内标混合物经过FASS后，再经CZE分离得到的电泳谱图。图2为浓度10 mg/L的标准品与内标混合物用常规CZE分离得到的电泳谱图。两图比较可看出，经过FASS后，灵敏度明显提高。但在富集后的谱图中(图1)存在未知峰，可能是由于试剂中的杂质经富集后形成的。

　　图1 4种苯丙胺毒品标准品与内标混合物的FASSCZE分离谱图(略)

　　Fig.1 Electropherogram of the mixture of 4 amine drugs

　　IS. 苯乙胺(benzylamine);1. 苯丙胺(amphetamine);2. 甲基苯丙胺(methamphetamine);3. 3,4methylenedioxyrmphetamine (MDA);4. 3,4methylene methamphetamine (MDMA);C: 5 μg/L。

　　图2 4种毒品与内标混合物的CZE电泳分离谱图(略)

　　Fig.2 Electropherogram of 4 amine drugs with conventional capillary zone electrophoresis (CZE)

　　峰标注同图1(浓度均为10 mg/L)。缓冲液为100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 2.5)，电迁移进样(10 kV,8 s)，分析电压20 kV(100 mmol/L phosphate buffer (pH 2.5) was used with sample electrokinetic injection at 10 kV for 8 s)。peak number as Fig.1; C: 10 mg/L。

　　3.2 水柱对在线浓缩的影响

　　本实验中，在样品和缓冲液间引入了一水柱。水柱的电导低于缓冲液，样品随溶液进入后，由于样品溶液和水柱的电阻大，形成高电场，样品离子迅速迁移至水柱与缓冲液的界面，随后迁移速率降低。因此，样品在界面处富集。显然水柱的长短将影响分离的效果和检测的灵敏度。

　　本研究分别实验了无水柱、在2.1 kPa下进水3 s和在3.5 kPa压力下分别进水为3、6、9和12 s 时(对应的水柱长度分别约为2、3、6、9和12 mm，根据在相同压力下水通过整个毛细管的时间计算得出)对分离和检测灵敏度的影响。试验结果表明，水柱长度在2 mm和3 mm时，峰响应较高，且峰形良好。水柱增大后，灵敏度改善不明显且分离变差。无水柱的情况下，灵敏度较低，且重复性较差。

　　3.3 在线浓缩CZE分析定量参数

　　3.3.1 定量线性考察用含内标苯乙胺5 μg/L的80%异丙醇的0.1 mmol/L H3PO4溶液配制4种苯丙胺毒品系列标准溶液0.05、0.1、0.5、1、5、10、15及20 μg/L,用建立的FASSCZE电泳条件进行分离测试，然后用毒品峰面积与内标峰面积的比值与毒品浓度作标准曲线。结果表明当毒品浓度较低时(低于5 μg/L)，响应与浓度间具有良好的线性关系。当样品浓度增大后，响应出现平衡现象，线性关系变差。

　　在线性关系良好的浓度范围0.05~5 μg/L内，建立标准曲线。当信噪比为3时，计算得出检出限(表1)。

　　表1 线性方程与检出限(略)

　　Table 1 Calibration equations and limits of detection (LOD)

　　Y: 毒品峰面积与内标峰面积比值(ratio of drug peak area to IS peak area);X：毒品浓度(drug concentration): μg/L。

　　3.3.2 定量重复性考察用标准品考察了浓度分别为0.1、1、5 μg/L的重复性，结果列于表2中。从表2可以看出，在浓度为5 μg/L时，分析的相对标准偏差在10%范围左右;当浓度为1 μg/L以下时，定量的重复性变差。

　　表2 定量检测的重复性(略)

　　Table 2 Reproducibility for quantitation

　　图3 空白与添加毛发经碱性条件消解、环己烷提取后，用FASSCZE方法分析的电泳谱图(略)

　　Fig.3 Electropherograms of the blank (a) and spiked hair (b) extracted with cyclohexane after alkali digestion

　　峰标注和电泳条件同图1(peak identities as in Fig.1 and also the same CE conditions as Fig.1)。

　　3.4 添加毒品的毛发分析

　　在所建立的在线浓缩的CZE分析方法的基础上，对添加毒品的毛发进行了提取测定。分析用毛发取自一无吸毒经历的15岁健康男性少年。首先将毛发用5%水溶液的清洁剂清洗10 min去除毛发表面油脂，然后用流水冲净清洁剂，在室温下自然干燥。再将毛发剪成约1 mm小段，按照吸毒者毛发中的一般含量(0.4~5 μg/g)添加毒品模拟中毒毛发进行提取测定。将毛发样品(约20 mg)加入0.75 mL 1 mol/L NaOH，于70℃水浴中消解30 min。将消解后的液体转移至2 mL的离心塑料瓶中。因为溶液为碱性，可直接用有机溶剂提取。加入075 mL环己烷，在涡流振荡器上振荡提取1 min，然后在离心机中将两相分离;用移液管将有机相转移至另一小瓶中，在氮气流下吹干溶剂，再用电泳分析用溶剂溶解，并用0.45 μm注射器滤膜过滤，然后用于CE分析。

　　图3为20 mg 空白毛发添加20 ng 4种苯丙胺毒品和内标后(相当于1 μg/g)，用碱性条件消解后再用环己烷提取，然后用FASSCZE分离后得到的电泳谱图。其中内标和苯丙胺、甲基苯丙胺的谱峰较小，加之其它杂质峰的共存，难于认定。推定原因一是苯丙胺和甲基苯丙胺的检测灵敏度较MDA和MDMA低，二是这两种毒品和内标的分子较小，在消解和提取挥发过程的损失较大，使毛发中的检出限减小。添加的毛发中MDA、MDMA显示了较高的灵敏度。

　　致谢对加拿大哥伦比亚大学David Chen 教授对本研究的支持与帮助表示衷心地感谢。

　　References

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