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层析法因成本而驱动

上一篇 / 下一篇  2011-10-26 13:05:04 / 个人分类:制备色谱

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  在追求经济的驱动下,生物分离技术在朝最大程度减少浪费、提高产能的方向进展,连续色谱法也开始进入了小分子领域。
  要生产治疗用蛋白,层析技术理所当然是生物分离的“圣杯”,Howard Levine博士,生物处理技术咨询公司的经理评价道。随着竞争日益激烈,生物制药公司等待生物制品的出现,成本问题推动了降低消耗提高产出的新型生物分离技术的发展。更高的流量和结合性能是当前层析系统的标志,而可移动的膜层析系统有助于进一步降低成本和浪费。
  同时,经济因素把层析技术,至少是它的形式,带到前所未有的地步,引入到更多小分子处理领域。
  总的来说,不论是大分子还是小分子蛋白的生产,都因需要降低处理中的浪费而推动层析技术的发展。“生物技术不能接受每个步骤50%的损失,”Pall 生命科学公司的高级科学家,John Jenco博士说。
  下游生物处理技术正在进步,以跟上上游工艺所获得的巨大进步。“我们已在上游和下游工艺取得了巨大进展,当然总的看来,下游的纯化工艺还没有与上游的生产同步,”Amgen公司的科学指导Duncan Low在波士顿去年9月份召开的IBC生物处理国际会议上如是说。
  层析技术与发酵相比,经济规模小,Low说。“你无需修改生物反应器的图纸就可以扩大发酵规模,但这不适用于层析柱,”他说。
  据Low所说,从1980年的5-50mg/L到今天,蛋白滴度增加了上千倍,争取在未来的3-5年增加到10-20g/L。高滴度意味着单位蛋白的体积变小,这有助于下游操作,而生物量的增加没有这个作用。
  纯化专家已经提供了很多改进,包括:
  ◆ 处理的集成和强化;
  ◆ 澄清工艺使用化合物滤膜;
  ◆ 更有效的树脂利用(包括重复利用)和更高的产品回收率;
  ◆ 可供选择的下游策略,如膜吸收器,液液分离,以及可移动性。
  高处理量和蛋白滴度增加了下游总体处理,尤其是层析处理的压力,Eric Grund,GE医疗公司的Fast Trak 生物制药的主管认为。即使如此,生产商仍致力于提供树脂和其他层析产品以改善流速和结合力。
  
  惠氏准备吨级MAb的生产
  由于高剂量单克隆抗体的成功,发酵正转移到越来越大的容器中进行。“毫无疑问,公司正在规划吨级的蛋白生产规模,”惠氏生物制药的纯化工艺研发主管,Brian Kelley说。惠氏,考虑到近期研发阶段有3个单抗产品以及生产线上的12个产品,正在计算工艺强化和层析平台策略对下游工艺的挑战,这些措施可通过内部或向生产商订购而过渡。
  惠氏研发部门的科学家已经把下游单抗普遍的3步层析步骤减为2步,蛋白A树脂作最初的截留,继以阴离子交换冲洗。惠氏略过了中间过渡柱——一般离子交换型憎水结合或羟基磷灰石,而是在截留前仔细清除细胞碎片,优化了该步骤,同时盘旋截留柱和阴离子交换柱获得最高的效率和产量。
  公司采用充满树脂的微孔作为微柱检测不同pH、离子强度和洗脱条件下的吸附和解吸附。通过优化离子交换步骤完成两个柱子的工作,要花一天时间,仅耗费约1g样品。“我们正在寻找阴离子交换步骤的最佳条件,”药物研发高级主管Jeff Deetz说。
  其他公司和生产商正研究使用微观方法来优化较大型的层析柱。通过与Ciphergen在工艺蛋白组学的合作,Pall现已提供高通量层析筛选服务,以制定生产规模的层析方法。在SELDI质谱技术基础上,此项技术是在包覆各种吸附介质的ciphergen的蛋白芯片上迅速筛选结合和洗脱条件。“该技术允许我们几小时就能做过去采用小层析柱几天甚至几个月的工作,”Jerold Martin,Pall 公司科学事务的高级副经理说。
  由于下游工艺的工作量赖于上游的生产效率,生物工艺专家必须早作决定,如何处理低容量的固定阶段,采用一根柱子(分批处理)或多根柱子。分批处理以弥补层析容量的不足会导致工艺的不确定性,也就是更多事务会出错。
  公用资源如缓冲液的制备,会在生产中引起不止是共享瓶颈的问题。多重层析柱的每一根柱子需要相同的一打缓冲液和清洗液,遍布生产车间,只能在有限的容器中生产。提前制备好这些复杂的缓冲液减少了缓冲液相关的规划错误,但增加了额外的储存成本(如不锈钢储液罐和额外的地面空间)。
  “根本的瓶颈问题是调度,”Intelligen公司的规划和调度经理Charlie Siletti说,该公司提供了工艺调度产品SchedulePro来消除此类难题。“大多数厂商没奢侈到有一打储液罐。”
  即使出现因资源共享导致的延迟,多数生产商没有采用简单的预防,如在各操作间留出缓冲时间,尤其是在发酵和截留层析之间。“进入下游操作的批次后来影响了随后的批次。”Siletti说。
  亲和层析,一度是生物处理技术的标志,得到创新发展以减少层析步骤。现在亲和配体包括金属螯合物,染料类似物,蛋白和免疫蛋白,以及更多普通蛋白A。
  包括在亲和类下的还有对毫微抗体蛋白产品特异性的亲和树脂。此类树脂把憎水性的电感层析与小分子结合起来,模拟天然的蛋白结合位点,与蛋白A类似物,或其他特异性的亲和蛋白相近。定制的树脂价格昂贵,但对量大的生物制品也是负担的起的。
  供应商努力使蛋白A配体化学惰性,经得起清洗。GE医疗公司的碱性稳定蛋白A,今年早些时候面世的,就是这些努力的结果。
  当然,还有一些人志于采用较为廉价的单元操作替代蛋白A和其他层析步骤。一些幸运的生产商,如Abbott实验室已经可以完全略过亲和截留介质。
  在其他情况下,可以应用较为低廉的蛋白A模拟树脂,如Pall公司的HyperCel单抗选择性树脂,价格为蛋白A的1/3,可被浓缩的腐蚀液清洗,还有亲和层析有限公司,Prometic 和其他厂商提供的模拟配体。  
  小分子层析:促销
  说服小分子生产商采用柱层析生产要花费一些力气。由于生产规模大,小分子柱层析成本高,又耗费时间。大型层析柱产生了大量溶剂,造成火灾的风险,也需要溶剂回收,大生产中洗脱的大量组分增加了分析任务,造成长的循环时间。“结晶会破坏层析,而且情况很普遍,” 惠氏化药研发部副经理Michael Kolb博士说。
  Kolb列举了层析、溶剂回收、能源和安全的资金成本,以及处理大量溶剂引入的成本,以此作为根本障碍。“想想看,那是非常昂贵的化合物,”Kolb说,“超过99%的情况下,我们采用结晶法来纯化化合物。”
  然而,支持者认为,层析技术还是有令人称道之处,尤其是不易结晶的化合物。连续层析提供了诸多生产的便利,正用于生产几种大规模的制剂,包括UCB公司的抗癫痫药物Keppra(levetiracetam),纽约Forest实验室生产的Lexapro/Cipralex(escitalopram)以及哥本哈根的H. lundbeck A/S。可供的选择有:模拟流化床层析(SMB)- 从20世纪60年代起在石油工业中发展起来的连续纯化技术,SMB已广泛应用在食品、化学、制药领域,最近已拓展到生物技术领域。SMB解决了药物生产商关心的问题,提供了很多便利,纯化单位材料使用较少溶剂,比批次层析的分离度高。
  20世纪90年代,Novasep公司发展SMB并引入了制药领域。它的生产规模的连续SMB系统采用多重柱层析,柱直径可达1米。
  Varicol-Novasep的另一项工艺,据说比SMB效率高20%。SMB要使用4根柱子,靠固液相的相对移动而分离,Varicol结合了共流和逆流运动,比SMB少用1至2根柱子,可达到相近的分离效果。在分离外消旋混合物中的对映体时有非常好的分离度。
  Varicol 和SMB都是两相分离系统,意味着只能纯化两种成分的混合物(准确的说就是外消旋物质的分离)。这就是经过手性层析分离后的化合物首先经过结晶消除洗脱快或慢的杂质。
  Novasep也销售制备和生产型的高效液相色谱,批次操作,从小分子到大分子蛋白采用的柱子直径可达1.6米。公司与费城的罗姆公司合作一项生物层析设备,基于高效树脂发展生物分子的分离。目前已研究了几项蛋白工艺,但仍不能用于单抗类的大分子。
  由于分离无用对映体的成本非常高,只有当手性能通过复消旋回收并再次流经手性柱,手性层析法才有意义。回收可使产率达90%以上,如果手性中间体没有自然消旋。“你必须以环形的合成方式考虑手性层析技术。”Novasep 母公司的主席Jean Blehaut说。
  循环或“稳态循环”层析法与SMB在以下几方面不同:
  采用一根柱子而非四根;容量和生产量较低;仍处于早期研究或实验室阶段而非生产阶段。
  在Eli Lilly公司,循环层析保证了生产规模达1公斤的药物的回收率。
  为分离外消旋体,循环层析要在洗脱过程中不断注入外消旋溶液,速率与主要的异构体洗脱速率相同。通过收集需要的流分,循环层析未分离的部分,提高了每次分离的分离度。
  “循环本质上把柱长增加了两到三倍,”Eli Lilly 的首席科学家 Joseph H. Kennedy说。“比标准的批次层析,柱载量提高了很多。”其他的好处比如,比SMB缩短了研发时间,设备简单,成本更低,方法的耐受性好,可达基线分离。
  循环层析的缺点是,作为两相分离技术,杂质问题不容忽视。迅速洗脱的副产物不象主峰后的拖尾让人头疼,但分离这些副产物决不简单。
  “没有理由解释循环层析不能放大,但SMB已发展到普遍应用到生产中的地步,”Kennedy说。“如果你有个手性分子能够结晶,这方法通常比层析法好。但现在制备的很多分子不能结晶。”   
  下游工艺的Abbott流水线
  Abbott实验室的单抗纯化旗舰平台采用阳离子交换而非亲和截留,改变了给料方式和随后的下游工艺。据纯化小组的领导James Stout博士介绍,工艺学中,较早时,上游工艺的困难是去除母细胞,以及性质与目标分子相近的蛋白杂质(亲和层析可能不会出现次问题)。Abbott也会遇到蛋白聚集、破碎,母细胞蛋白的变异性,蛋白变性和沉淀,以及常见的容量问题。
  每升树脂能结合100g或更多蛋白的超级树脂的出现,且不会破坏分离度和生产量,有助于协调上下游容量矛盾。Abbott实验室也重视旧操作中的问题如结晶,选择沉淀或液液萃取可降低处理量,杂质量,以弥补层析法的不足。
  Abbott相信工艺分析最终有助于减轻上下游工艺容量的不匹配。为去除杂质,工艺规划和层析曲线可为细胞培育提供反馈,以减少某一副产品。“基于生产/纯化和分析,层析法一定是这些评估的中心,”Stout补充说。
  对传统的柱层析而言,膜吸附技术可能是一个替代措施,“但全方位衡量后层析法仍占优势。”



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naren4545 引用 删除 naren4545   /   2012-02-28 19:28:07
生物大分子还是离不开树脂!
 

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