高压反相制备工艺-----旋光浩儿/chrispand

　　反相高压液相层析是一种普遍应用的高压液相层析技术。它使用一非极性的固定相和一极性的移动相，尤其适合分离非极性和中等极性的化合物如多肽。

面对新拿到的样品应该如何去操作，现整理一份流程如下：

　　1. 原始样品分析

　　用分析型HPLC(填料5u)对样品进行分离，并对流动相进行改进，直到主峰和杂质完全分离，摸索好的条件用来对以后纯化后的样品进行纯度分析。

　　2. 分析柱模拟制备

　　高压反向制备填料一般为10u，将10u的ODS填料装一支4.6×250mm的柱子。由于制备一般不能使用非挥发性的酸碱盐，因此可能需要重新摸索条件。在主峰和杂质分离充分的条件下开始做过载实验，过载实验因为成本因素(样品，流动相，填料)必须在分析设备上操作。然后将主峰分段收集，一般为分成10段左右，并分别进行分析，测定纯度和回收率，从而进一步优化制备条件。

　　Ps：上样量可以先选择填料质量的3‰进行实验，如果回收率能达到要求，可以继续增加上样量，上样体积尽量小，浓度尽量大；同时尽量使用流动相溶解样品。

　　3. 制备系统的放大

　　将分析柱模拟制备的条件及上样量等线性放大到制备柱上(制备柱规格根据实际样品量来决定)，同样将主峰分段收集，一般为10段左右，并分段进行分析，将纯度合格的段合并到一起并计算回收率。重复几次，至工艺成熟后，可以每次将主峰只分为4-6段。

　　PS:上样量计算公式、柱流量计算公式

　　进样量估算公式

　　M₂=M₁*(D₂²*L2)/(D₁²*L1)

　　柱流速估算

　　F₂=F₁*(D₂²/D₁²)

　　M₂制备柱所允许的上样量

　　M₁分析所允许的上样量

　　D₂制备柱直径

　　D₁分析直径

　　F₂制备泵流速

　　F₁分析泵流速