MRM定量的三言两语

上一篇 / 下一篇  2011-08-20 12:58:18 / 个人分类:质谱

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MRM只提供了一种质谱的操作模式,具体的样品怎么做,用来做什么那就看创意了。

简单说是用质谱进行蛋白质定量可以分为内标定量与外标定量。 

不管是内标还是外标都需要有一个标,这个标就是合成的标准肽段。 

外标定量需要做标准曲线。

通常我们合成感兴趣的需要定量的蛋白质的proteotypic peptide, 轻同位素,首先按照已知浓度制定标准曲线。

然后测量未知样品的该肽段的质谱信号强度,根据信号强度反推样品浓度。

这种定量测量与Bradford法完全一样。 


另一种就是内标法,内标法事一种相对强度法。从某种意义上讲,质谱上使用的内标法才是真正的内标法,因为质谱可以分辨同位素的差别(符合色谱定量内标选择的基本原则,最好的选择就是同位素的差别,而其他化学性质基本可以保持一致)。这时我们需要合成的是目标肽段的重同位素对性形式,把已知浓度的重同位素肽段掺入到样品中在一次LC的run中就可以同时检测已知的重同位素的信号强度以及样品中轻同位素的信号强度,根据两者的信号相对值就可以计算出样品中的肽段浓度。 

所以,外标法与内标法各有所长:外标法不需要合成重同位素肽段,因此成本可以降低,但是需要多次run,而且多次run的variation也会较大;相反,内标法可以在一次run中搞定,这样就避免了样品各次run之间的变异,但是需要合成重同位素肽段。

还好,重同位素只需要特定氨基酸标记就可以了,标准是能够与相应的轻同位素肽段在质谱上得到分离,最好是同位素峰不会造成相互干扰,这最好至少有4个Da的差别。 

外标法的标准曲线有两种,一种是过原点,一种不过原点,本质上或者说是理论上,标准曲线应该是过原点的,但是由于操作原因或者是实验本身的特殊原因,可能会不过原点,比如在Bradford法进行蛋白质定量时的标注曲线就不是过原点的,因为在不加蛋白质时仍然会有本底的光吸收,当然我们可以通过多种方式还原真实的状态,比如在进行光吸收测定时就进行归零,或者在绘制标准曲线是直接把截距归零。但是要注意这样做的一个前提是各个测量点具有相同的本底,即基线,注意是基线,而不是噪音。这种基线与噪音的本质区别是基线不会淹没信号,信号永远在基线之上,即基线只会使信号升高,通过与blank做减法就可以得到真实的信号强度,而噪音则会淹没信号,若信号强度不是很高,即通常我们所说的信噪比不高,我们就不能把真实的信号剥离(得到真实的信号峰型)。

由于质谱的灵敏度很高,质谱(色谱也是一样)上测定的信号就会被噪音淹没掉一部分,当信噪比高时,噪音对定量结果的影响不是很大,反之就会对定量的影响急速增加,特别是在内标定量法上,噪音的影响特别值得注意。有噪音引起的截距变化是不能通过简单的截距归零或者直线平移解决的。 

质谱外标法定量标准曲线理论上应该是过原点,较小的截距,特别是负截距都是可以接受的,特别考虑到噪音的影响,使具有一定浓度的标准品也不一定有信号反馈。简单的说就是一个Bradford定量法。 


对于质谱内标法的定量的数据处理,目前有很多的方式。上面说过,内标法其实就是一个相对强度法,但是这里也存在一个线性回归的问题,默认是一个包括原点在内的两点定一线。这里面有很多的细节问题需要谨慎处理。比如到底是用峰面积还是用峰高来定量。当然这个问题在外标法中也会遇到。对于较好的峰型,不存在这个问题,因为峰高与峰面积的定量结果是一致的,为什么是一致的呢?

对于两个正态峰来说,任何一点的峰高之比理论上都是相同的,所以面积只不过是把所有的点的峰高进行积分而已。若峰型不规则(不对称,严重拖尾,以及出现裂缝肩峰等)就不符合上面说到的这个原则,自然峰高与峰面积的定量结果就不一致了。

第二个需要考虑的问题就是噪音,当信噪高时噪音对定量结果的影响不大,可以忽略,但是当信噪比较低时,若直接采用噪音之上的信号,无论是峰高还是峰面积都会造成很大的误差。

2009-12-08 13:33

TAG: mrm 内标 外标 质谱定量

 

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