高精度质谱数据的MS2母离子归属问题

上一篇 / 下一篇  2011-08-20 13:02:47 / 个人分类:液质联用

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问题:高精度数据,如orbitrap,在进行SILAC标记定量实验中,如用K4进行标记,会发现K4标记的肽段的鉴定数量要远远小于正常的肽段。

原因:回去查询MS2图谱,会发现,extract.msn这个脚本把K4对应的MS2图谱的前体离子归结到其第一同位素即K0对应的前体离子上,这样,本来应该为K4标记的肽段,却错误的认为是K0的肽段。

这个过程与搜库本身没有关系。K4标记的肽段的y系列离子虽然都是标记的,但是由于MS2是在离子阱内得到,本身的数据精度达不到,所以在搜库是完全可以忽略由于标记带来的质量差别。所以理论上对于K0或者K4对应的肽段的MS2图谱可以认为是相同的,当然这是对于搜库来说。也就是说搜库的结果并不能区别K0与K4,那么是哪一步来确认是K0还是K4呢?

问题就出在extract.msn这一步上,即从raw文件提取MS2图谱这一步上。
首先理一下orbitrap一个ms循环的过程,暂考虑动态排除:

1、在orbitrap中进行高精度的MS1扫描;按照强度对离子进行排序,比如1到10位;

2、按照前面MS1的队列在LTQ里面进行二级质谱

3、比如排位第一的为m/z 500.143的离子,那么在LTQ里面就会在左侧1.5,右侧1.5这个window(具体数值可以设置)内进行母离子的isolation,然后进行CID碰撞断裂,进而得到MS2图谱;这个MS2的图谱在raw文件中记录为500.143@…………,在正常的鉴定中这个过程(上面第三步)一直循环;

4、若上面这个肽段有一个同位素标记的对应的肽段为502.143,也排在了前十位,那么也有机会进行MS2的分析,这样同样可以得到一样MS2图谱,502.143@…………,

好了,数据已经产生了,本来,上面这两张图谱分别属于两个不同的母离子,但是extract.msn这个脚本却自作聪明,认为502.143@…………这个图谱是的母离子是500.143@…………的母离子的同位素峰,从而认为502.143@…………的最终的母离子也是500.143,因而生成的dta中的母离子信息由502.143被篡改了500.143;
至于extract.msn这个脚本为什么会这么认为无从考证,但是可以肯定的是,脚本在进行上面母离子归结时很可能读过该MS2图谱对应的母离子window内的MS1图谱,同时做了一定的同位素pattern分析,否则也不会做出这样愚蠢的决定,另一种可能性是没有考虑到同位素pattern,认为所有在设定范围内的峰都是同位素峰。

上面说的第三步中应该没有考虑同位素峰的问题,即没有考虑第一同位素与第二同位素高低的关系,而仅仅是按照强度进行的排序。由鉴定结果看,大部分离子都是二价的,考虑到第二同位素问题,isolation window至少应该是前后0.5,前后1比较保险,但是考虑到LTQ的准确度,是前后1.5个m/z(系统默认前后1),从这个意义上讲,虽然理论上上面两个母离子是单独进行分离并分析得到的MS2,实际上被分析的离子可能大部分是相同的,这也是两个MS2图谱几乎相同的原因(除去上面说到的同位素本身对y系列离子的质量在LTQ上的影响较小)。
现在对整个过程应该比较清楚了。
母离子信息的唯一来源就是高精度的MS1图谱,上面说过,extract.msn会分析MS2图谱对应的母离子window内的MS1图谱,比如分析502.143@…………这个MS2图谱时一定分析过至少是包含510这个母离子在内的window的MS1图谱的同位素pattern,遗憾的是,它没有能够准确地做出502.143是一个独立的母离子的判断。当然我们不得不承认这个识别的过程可能是比较复杂,要考虑到一个肽段的同位素峰的强度pattern,500.143这个肽段在502.143一定有一个同位素峰,但是这个强度一定不是现在这独立的肽段的强度。若使用profile模式扫描,各个同位素峰的相对强度值会更准确,会有利于上面的这个识别过程。

说到这里,又看到了一个可能的后果,就是502.143这个位置不是在同位素标记定量实验中的对应的重标肽段,而是在普通的鉴定实验中的一个完全不相干的肽段,extract.msn仍然把他认为是500.143的同位素峰,而且其MS2的母离子仍然认为是500.143,这样就会出现错误的结果。当然,若是存在这样的情况,由于上面降到的isolation window的问题,两个母离子对应的MS2可能也好不到哪里去,因为是两种母离子的混合二级质谱图,这样的图谱搜库本身也是问题,即使分值合格也应该是错误的结果,那么这样是不是也可以作为一个筛选的标准呢?若能确认一个MS1后的两个不相关的离子靠的很近(如2个m/z以内),且都被鉴定,这样的结果的FPR应该很高。

说了这么多,其实最根本的问题还是同位素pattern识别问题,在以前进行的O18标记定量时就有人曾考虑过这个问题。相信随着质谱精度的提高,以及算法的优化,这也不是个问题了。

当然出现这个问题并不会最终影响定量结果,如果你是用较好的软件进行同位素标记定量的合适处理,只会在鉴定结果上给人假象。

2009-07-03 09:32

TAG: orbitrap silac 蛋白质组

 

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