粘红酵母CIBAS A 1401苯丙氨酸解氨酶(PAL)的分离纯化与性质

上一篇 / 下一篇  2010-09-18 11:35:50

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  1.PAL酶的分离纯化与性质

  应用选出的高PAL活性的粘红酵母CIBAS A 1401-37号菌株,在Ⅱ级发酵至21h时,生物量达到最高,PAL酶活力最高,且能维持活力峰值期2~3h;在此时搜集菌体纯化该PAL酶最适宜。经试验发现,用直径0.5㎜的采用玻珠破壁5~6次时,有最佳效果;用硫酸铵分级沉淀时,选择40%~65%饱和度,沉淀效果最好。获得的粗酶液再经Sepharose4B凝胶过滤和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换,得到最终纯化倍数为139倍,收率为12.6 %的结果 。

  经纯化得到的酶液,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析均得到单一蛋白带,证明该酶已经达到凝胶电泳纯,且其亚基大小相等。由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条带上,其PAL亚基的相对迁移率和由标准蛋白质迁移率所配的标准曲线,插值分析可得出该PAL的亚基分子量约为79.4kDa。

  该PAL制剂在不同的金属离子氯化物体系中,除了Mg2+ 和Na+外,其它金属离子如Fe3+、Cu2+、Co2+、Hg2+等对其都有明显的抑制作用。

  PAL的酶反应动力学参数:根据Lineweaver-Burk 作图法,在pH8.5,40℃条件下测得本粘红酵母CIBAS A1401 PAL L-Phe生成t-Ca的Km值为3.87×10-4mol/L。

  在不同温度和不同pH值条件下测试发现:在pH8.5时,该酶的最适温度为40℃;在40℃,该酶的最适反应pH为8.5,在pH8.0~9.5 之间有较好的稳定性。在无防腐剂和保护剂的条件下,4℃和-20℃保存2周活力下降分别不到40%和20%。

  该酶在50℃以下,尤其是在最适反应温度以及更低温度下,都有较高的稳定性,这就是为什么该菌株能用于工业生产L-Phe的优势所在。

  本工作将粘红酵母CIBAS A1401 PAL的部分酶学性质与已经报道的高等植物PAL的性质作了比较研究,发现都不同程度地证实了酵母PAL与高等植物PAL有着相似的结构大小和生物学特性;但这并不说明它们就完全一样。据报道,酵母PAL的活性部位的结构与高等植物有着较大的差异,且PAL在植物和酵母体内所起的生理功能是有区别的。

  2.PAL基础酶学问题辩析

  据报道,PAL有酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia-lyase,TAL)活性,催化酪氨酸(Tyrosine,Tyr)解氨生成对一香豆酸(4-羟-肉桂酸);一般来说,TAL活性不总存在。有人认为该PAL存在两种酶形式,实验结果表明,其PAL和TAL最适PH不同,动力学参数(Km值,Kcat,Kcat/Km)不同,但都有类似的催化效率。

  对于粘红酵母A 1401而言,在使用该菌种在发酵培养制作细胞作为PAL生物催化剂时,对其液体培养基中的两种芳族氨基酸(L-Phe,L-Tyr)作为PAL的诱导剂对其代谢利用过程的差异分析结果表明,该菌首先代谢利用L-Tyr,其次才是对L-Phe的代谢利用;由此可以推断本菌株经芳族氨基酸诱导生成的PAL酶系中也存在优势的TAL酶活性;这在本实验室的红酵母对三种底物,即间-羟-肉桂酸,邻-羟-肉桂酸和对-羟-肉桂酸生物转化制L-Phe结构类似物,即间-羟-L-Phe,邻-羟-L-Phe和对-羟-L-Phe(即L-Tyr)的筛选和制备合成试验中,实际上就是TAL(酪氨酸解氨酶)逆向生物催化合成天然(L-Tyr)和非天然L-Tyr的结构类似物,具有生物技术应用的重要性。

  因此,从基础酶学角度分析,实际上该菌存在两种酶形式,即PAL和TAL;PAL/TAL的比率取决于菌种及其生理营养条件。不过通常认为两种酶活性均可对肉桂酸被直接立体氨化合成L-Phe起作用。表1给出了该菌株在生物催化剂制备阶段,优先代谢利用作为PAL诱导剂的Tyr,然后才是L-Phe的结果。由此表明该菌株存在两种酶的形式,且TAL可能较PAL占优势。


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