吸附固定相电色谱和动态改性电色谱的手性分离

上一篇 / 下一篇  2010-06-25 14:54:03 / 个人分类:手性分离

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  很多手性药物的不同对映体有不同的药效,美国食品和药物管理局规定,今后凡发展具有不对称中

  心的药物,必须给出手性拆分的结果.对手性药物分离分析技术的需求是制药工业面临的重要挑战之

  一.电色谱综合了毛细管电泳高效液相色谱的优越性,具有高效,快速,选择性强,运行成本低等优

  点.电色谱在手性拆分方面也有广泛的应用前景.Mayer等〔1〕在毛细管壁涂布环糊精,率先进行了开管

  电色谱手性分离实验.此后,电色谱手性分离的研究越来越多〔2〕.在国内,魏伟等〔3〕通过在流动相中添

  加羟丙基环糊精,在硅胶填充柱电色谱中成功地分离了两对碱性药物异构体.朱军等〔4〕利用β2CD填充

  柱色谱柱分离了安息香,美芬妥因等手性化合物.刘震等〔5 ,6〕通过在毛细管管壁吸附碱性蛋白,肽等,

  用开管电色谱模式分离了一些手性化合物.

  动态改性电色谱(DMS2CEC) 是最近由我们发展出来的一种电色谱模式〔7 ,8〕.它是在流动相中添加

  少量改性试剂,主要是一些离子性的表面活性剂,这些改性试剂动态地吸附于填料的表面,形成一层准

  固定相.在DMS2CEC中的溶质主要根据本身的电泳淌度及与准固定相的相互作用而得以分离.本实

  验采用磺化的β2CD作为改性试剂,对强阴离子固定相(SAX)进行动态改性,动态吸附于SAX填料表面

  的β2CD形成一层手性固定相,从而使本系统具有手性拆分能力.此外,在SAX填料表面直接物理吸附

  蛋白质和磺化β2CD进行手性分离也进行了尝试,并比较了物理吸附和动态吸附磺化 β2CD的优缺点.

  2 实验部分

  211 仪器和材料

  P/ ACE MDQ型毛细管电泳仪(Beckman公司).乙腈,甲醇为色谱纯试剂,水为二次去离子水.5μm

  粒径的强阴离子交换固定相(SAX) (美国的Water Phase Separation公司);内径为50μm的毛细管(河北永

  年光纤厂);牛血清白蛋白(BSA)购自华美公司,色氨酸(中国科学院上海生物化学研究所),其它手性试

  剂(Sigama公司).磺化的β2CD(S2CD) (Aldrich公司),其磺化率为7~11.本文涉及的手性样品的结构

  式如下:

  212 电色谱的制备

  采用匀浆法填充 SAX电色谱柱,其装柱过程见文献〔7 ,8〕.SAX电色谱柱的总长为31 cm ,填充柱

  长 10 cm.将BSA吸附于SAX固定相上的方法与文献〔10〕相似.将SAX电色谱柱装上电泳仪后,利用

  其压力系统,在 345 KPa下先用50 mmol/ L和10 mmol/ L磷酸缓冲液(pH 6. 8)各冲洗30 min ,用2 g/ L BSA

  的磷酸缓冲溶液(10 mmol/ L ,pH 6. 8冲洗7~8 h ,接着用50 mmol/ L磷酸缓冲溶液(pH 6. 3)冲洗6 h ,用1

  mmol/ L的磷酸缓冲溶液(pH 6. 3)冲洗30 min ,最后用5 kV和10 kV电压各平衡1 h.在进行手性分离中

  流动相不含BSA.

  SAX电色谱先用含10 %甲醇,20 mmol/ L乙酸2三乙胺(pH 4. 0),2. 0 g/ L S2CD的流动相平衡1 h ,使

  S2CD吸附于 SAX填料.然后,改用不含S2CD的流动相平衡30 min ,进行吸附S2CD柱手性分离.在动

  态改性电色谱实验中,电色谱柱直接用含S2CD的流动相平衡30 min后进行实验.

  213 色谱条件

  分离电压设为10kV或15 kV ,电动进样3kV×5s ,检测波长为214 nm ,温度为25℃.

  3 结果与讨论

  311 吸附固定相电色谱手性分离

  最近,刘震等〔7 ,8〕将碱性蛋白,肽等吸附于毛细管管壁,成功的进行了开管电色谱手性分离实验.

  实际上,在液相色谱中也可以将蛋白质吸附于硅胶,离子交换等载体上,进行手性分离〔9 ,10〕.但这种方

  法尚未在填充电色谱中得到应用.本工作将BSA 吸附于SAX固定相上进行手性分离,图1所示为SAX

  固定相吸附BSA前后分离色氨酸的电色谱图.在蛋白质吸附之前,只出一个峰说明此时该柱没有手性

  拆分能力,而吸附蛋白以后,D型和L型色氨酸获得较好的分离,分离度达3186.D型色氨酸由于与

  BSA的相互作用小,比L型先出峰.实验中发现SAX固定相在吸附蛋白质前后,电渗流的方向没有改

  变.其原因可能是SAX吸附蛋白质还没有达到饱和,填料表面仍然以正电荷为主.蛋白质吸附于SAX

  填料表面,其色谱分离的稳定性是关键因素之一.以5 %乙睛,2 mmol/ L的磷酸缓冲溶液(pH 6. 3)为流

  动相对其重现性进行了考察.连续运行16次,结果表明死时间和D型,L型色氨酸的迁移时间重现性

  比较好,它们的相对标准偏差(RSD)分别为015 %,0153 %和0181 %.这说明吸附在填料表面的BSA不

  易被洗脱.D型和L型色氨酸的平均柱效分别为40 ,110和12 ,835理论塔板数/米,柱效比较低.

  SAX填料吸附S2CD后也有手性分离能力,图2是分离D,L色氨酸的谱图.由于分离机理不同,色

  氨酸异构体在吸附蛋白质柱上和吸附S2CD柱上的出峰顺序不相同.在吸附蛋白质柱上,由于L型色

  氨酸与BSA作用力强,D型先于 L型出峰,而在吸附S2CD柱上则相反.吸附S2CD的柱效较高,D型和

  L型色氨酸的平均柱效分别为71 ,000和66 ,000理论塔板数/米.但由于选择性比较差,分离度比吸附

  蛋白质低,为2. 97.SAX填料本身带正电,电渗流应该从负极流向正极,但在实验中发现SAX填料吸附

  S2CD后,电渗流方向相反.这主要是由于SAX填料表面的正电荷被S2CD中的部分磺酸基所中和,而另

  一侧的磺酸基使填料表面带负电,从而导致电渗流反向.对吸附S2CD柱电色谱分离色氨酸的重现性也

  进行了考察.在流动相为10 %甲醇,20 mmol/ L乙酸2三乙胺(pH 4. 0)和分离电压为10 kV下连续运行

  17 次,死时间,L型和D型的出峰时间的RSD分别为1115 % ,913 % ,913 % ,重现性比吸附蛋白质固定相

  差.实验表明,死时间随着运行次数的增加而增加,其原因是由于吸附在填料上的S2CD随着运行时间

  的增长而流失,导致填料表面净负电荷减少,从而使电渗流减小.由于电泳机理的参与,液相色谱中保

  留因子已不足以表征带电样品在CEC中的迁移行为,为此定义电色谱保留因子(k3)〔11 ,12〕:k3=(tr-

  003 分析化学第29卷

  t0)/t0,式中t0和tr分别为死时间和样品的迁移时间.实验结果表明,在吸附 S2CD电色谱中,色氨酸异

  构体的k3随着运行次数的增加而减小,这也说明S2CD的流失,从而使色氨酸在柱中的保留减小.由此

  可见,与蛋白质相比,S2CD更容易从SAX填料上脱附,吸附S2CD电色谱重现性比吸附蛋白质固定相电

  色谱更差.

  图1 强阴离子交换电色谱柱在固定相(a)不吸附和

  (b)吸附BSA时分离色氨酸的谱图

  Fig. 1 Chromatograms for separation of tryptophan in strong

  anionic exchange capillary electrochromatography(CEC)with

  stationary phase(a)without adsorption and(b)adsorption of

  bovine serum albumin(BSA)

  实验条件 (experimetanl condition):电色谱柱总长(total length of

  capillary column)31 cm ;填充柱长(packed column length): 10 cm ;内

  径(I. D.)50μm ;填料(packing),5μm SAX ;流动相(mobile phase),1

  mmol/ L的磷酸缓冲溶液(phosphate buffer);分离电压(separation

  voltage), 10 kV ;进样(injection), 5kV×2s ;检测波长(detection

  wavelength),214 nm ;温度(temperature),25℃.样品(solute),色氨

  酸(tryptophan).

  图 2 S2CD吸附柱电色谱分离色氨酸的色谱图

  Fig. 2 Chromatogram for separation of tryptophan in adsorbed

  sulfated2β2cyclodextrin(S2CD)CEC

  实验条件 (experimental condition):流动相含10 %甲醇,20 mmol/

  L乙酸/三乙胺(pH 4. 0) (mobile phase contained 10 % methanol , 20

  mmol/ L acetic acid/ triethylamine(pH 4. 0).其它条件同1(other

  conditions were the same as that in Fig. 1).

  图3 动态改性电色谱分离色氨酸,阿托品和异博定的

  谱图 Fig. 3 Enantiomer separation of tryptophan , atropine and

  verapamil in a single run in dynamically modified stationary

  phase(DMS2CEC)

  实验条件(experimental condition):流动相含30 %甲醇,20 mmol/

  L乙酸/三乙胺(pH 4. 0)和2 g/ L磺化CD分离电压(the mobile

  phase contained 30 % methanol , 20 mmol/ L acetic acid/ triethylamine

  (pH 4. 0)and 2 g/ L S2CD)15 kV.其它条件同1(other conditions

  were the same as that in Fig. 1).样品(solutes): 11L2色氨酸(L2

  tryptophan);21D2 色氨酸(D2tryptophan);3和41阿托品对映体(3

  and 4 enantiomers of atropine); 5和61异博定对映体(5 and 6

  enantiomers of verapamil).

  312 动态改性电色谱手性分离

  固定相的流失是吸附固定相电色谱的致命弱

  点,是其重现性差的主要原因.动态改性电色谱与

  吸附固定相电色谱的区别主要表现在流动相的组成

  上.在动态改性电色谱中,在流动相中添加一定浓

  度的被吸附物质,经过一段时间的平衡后,这些物质

  在流动相和固定相中达到平衡,因此被吸附于固定

  相中的物质不会因为运行时间增加而流失,所以动

  态改性电色谱可以获得较好的重现性.在以SAX

  固定相为填料的电色谱中,于流动相添加2 g/ L S2

  CD ,平衡一段时间后,进行色氨酸分离.连续运行

  17次,t0基本上不随运行次数的增加而增大,其

  RSD为0. 53 % ,k3也没有明显的下降趋势,对映体

  的k3的RSD分别为0. 62 %和0. 69 %.与吸附磺化

  CD电色谱相比,动态改性电色谱有更好的重现性.

  其原因是由于动态吸附于填料表面的磺化CD不随运行次数的增加而减少.

  图3所示为在一次运行中分离色氨酸,阿托品和异博定的谱图.流动相中含30 %甲醇,20 mmol/ L

  乙酸/三乙胺(pH 4. 0)和210 g/ L S2CD.色氨酸的等电点为5189 ,阿品托和异博定为碱性药物,在pH 4.

  103第3期叶明亮等:吸附固定相电色谱和动态改性电色谱的手性分离

  0时都带正电,在电场的作用下,应该移向负极.吸附S2CD后,SAX填料表面带负电,电渗流也流向负

  极. 样品的电泳方向与电渗方向一致,样品应该在t0之前出峰,但由图3可见,样品峰都在t0峰之后出

  现.这说明样品分子与固定相之间有很强的相互作用.由于填料表面带负电,离子交换机理势必影响

  样品的迁移,这可能是样品在本系统中保留强的主要原因,但是无论是溶质本身的电泳迁移机理,还是

  与吸附固定相的离子交换机理,都不能使对映体分离.手性化合物之所以能在本系统中得以分离,主要

  是由于对映体与吸附于填料表面的S2CD之间形成包结络合物的能力不同造成的.图3中各峰的柱效

  介于85 ,000和412 ,000塔板数/米之间,柱效远比以β2CD为填料的电色谱要高〔4 ,13〕.在离子交换电色

  谱中往往能取得高柱效,本实验高柱效的取得可能也与离子交换机理有关.图3中色氨酸,阿托品和异

  博定对映体间的分离度分别为2106 ,1011和1196 ,分离效果很好.

  References

  1 Mayer S , Schuring V J .High.Res.Chromatogr. ,1992, 15(2):129~131

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  4 Zhu J un(朱 军), Zou Hanfa(邹汉法), Shi Wei(施 维), Rui Jianzhong(芮建中), Ni Jianyi(倪坚毅), Zhang Yukui(张玉

  奎).ScienceinChina,SeriesB(中国科学(B辑) ),1999, 29(5):418~425

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  13 Li S , Lloyd D K.J.Chromatogr.A,1994, 666(2):321~335

  Chiral Separation by Capillary Electrochromatography with Physically

  Adsorbed Stationary Phase and Dynamically Modified Stationary Phase

  Ye Minglian , Zou Hanfa3, Lei Zhengdeng , Wu Renan , Li Jianyi

  (NationalChromatographicResearchandAnalysisCenterDalianInstituteofChemicalPhysics,

  ChineseAcademyofSciences,Dalian116011)

  Abstract A novel mode of chiral separation in electrochromatography(CEC)with dynamically modified stationary

  phase(DMS2CEC)was presented. The capillary column was packed with strong anionic exchange stationary phase ,

  the sulfatedβ2cyclodextrin(S2CD), which was added in the mobile phase , dynamically adsorbed to the packing

  surface and a new layer of chiral stationary phase was formed. The separation of enantiomer was based on their

  different interaction with the new stationary phase. The enantionmers of tryptophan , atropine and verapamil were

  successfully separated in this system with resolution of 2. 06 , 10. 1 and 1. 96 , and the column effeciency for the

  enantiomers were varied from 85000 plates/ m to 412000 plates/ m. The relative standard deviation(RSD)of void

  time and the tryptophan enantiomers′migration time for 17 consecutive runs were 0. 5 % , 0. 6 % and 0. 7 % ,

  respectively. Enantiomer separation by capillary electrochromatography with adsorbed bovine serum albumin(BSA)

  and sulfated cyclodextrin(S2CD)as chiral stationary phases were also studied. The resolution for tryptophan

  enantiomers in the two systems were 3. 86 and 2. 97 , respectively. It was found that the superiority of DMS2CEC

  over the adsorbed S2CD column CEC was that better repeatability could be obtained in DMS2CEC.

  Keywords Capillary electrochromatography , dynamical modification , adsorbed stationary phase , enantiomer

  separation


TAG: 手性分离

 

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