浅谈多功能酶标仪选择的要素

上一篇 / 下一篇  2011-02-21 10:40:06

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近 年来,随着多功能酶标仪在国内各高校实验室逐渐推广开来,多功能酶标仪品牌和型号也逐渐多了起来,乱花渐欲迷人眼。除了三大传统优势品牌PE、MD和 TECAN,还出现了众多后来者插足此市场,如收购了芬兰雷勃的Thermo、从发光起家的Berthold、针对药筛领域的BMG以及新兴的 BioTek等品牌。各品牌都有各自的一个甚至多个系列产品线,特性各不相同,选购时各种技术参数、技术指标令人眼花缭乱

本文尝试从用户实际使用的角度,探讨应该如何看待花样繁多的参数特性,希望能帮助大家找到真正合适自己的多功能酶标仪。

一、滤片Vs光栅

多功能酶标仪的分类方法众多,但最简单的莫过于用他们的滤光方式来作分界线。一般来说,可以分为滤光片型和 光栅型两大类。当然也有一些型号,例如Synergy4和EnVision等,一台机器里面同时装上了滤光片和光栅。但是滤片和光栅并不能同时完成同一个 检测,还是想用光栅的时候用光栅,该用滤片的时候用滤片;还有一些实验非用其中一个不可,另一模块实现不了的。所以这类仪器本质上还只是把滤片和光栅放在 了一起,并没有使两者糅合而产生新的技术突破。

总体来说,滤片技术由于发展已久,配合二向色镜(其实也就是另一模式的滤光反光滤镜)等光路系统,可以实现 大部分实验的需要。目前常规多功能酶标仪中最高的检测灵敏度就是用滤光片型做出来的,例如TECAN Infinite F500的荧光检测的灵敏度可以达到0.04 fmol/孔(荧光素,384孔/80ul)。

但是滤光片型仪器由于受限于滤片的波长和数量限制,不可能满足日益增加的实验类型的检测需要,而且有时需要对物质的吸收、激发和发射光谱进行研究,所以后来就诞生了光栅型的仪器。

最先推出光栅的是MD公司,其光栅习惯上称为单光栅。由于光纯度的不足,在光栅的后面又加入了一组带阻滤 片,再把杂光过滤一遍,达到了5×10-4的杂光率,基本与纯粹的滤光片系统一致。后来TECAN又发展出了双光栅技术,通过两次光栅滤光,杂光率降到了 10-6。后来,Thermo、BioTek和PE的部分新款仪器等都使用了类似双光栅技术。由于激发和发射各用了一组双光栅,此类机器又被称为四光栅型 多功能酶标仪。

光栅型酶标仪的推陈出新,使得用户在波长选择上不再受限,而且在杂光率、带宽控制等性能上还超越了滤光片系 统。例如,TECAN公司在2008年底推出使用了第三代四光栅系统的M1000酶标仪,杂光率降到了2×10-7的新低,还实现了带宽2.5~20nm 连续可调。这些都是目前滤光片型酶标仪所不能或者较难实现的。

二、杂光率&波长准确性

光栅型滤光系统俨然已经成为了目前通用性多功能酶标仪的主流,多家厂家共同努力,已经把光栅技术推到了历史新高。在光栅的众多技术参数之中,最关键的无疑就是光栅的杂光率和波长选择的准确性了。

杂光率指得就是光源通过光栅后,得到的光线中,“不需要”的波长的光占所标称波长的光的比例,表征了滤光的 纯度。由于光线干涉、衍射等的复杂性,无论使用滤光片还是光栅,杂光都是不可避免的。各种滤光技术的本质就是要想办法把杂光尽可能地去掉。一般来说,滤光 片型的杂光率在10-4~10-5之间,光栅型的可以做到10-6~10-7。由于此类杂光是非特异的,而且会直接进入最后的检测器,所以有多少的杂光就 会引入多少的随机误差。在荧光等检测过程中,由于检测器存在放大效应,杂光率的干扰也会被指数级放大。因此,杂光率就是一个滤光系统的首要性能指标。

光栅的另一个重要指标就是波长选择的准确性。因为很多检测是依赖于物质在某个波长的特征图谱。就像 DNA/RNA的OD260浓度测定,实际检测波长偏离260nm几个nm以上的话,OD值与最终浓度之间的数学关系就会发生改变。因此,一组性能优良的 光栅系统,他的波长选择准确性应该是在±0.5~1nm之间。波长偏离过大有时就会影响到最终结果的准确性。

这两个可谓是光栅甚至滤光片滤光系统最关键的技术参数,直接影响到的是得到数据是否是真正所要测量的结果,是实验结果可靠性的最基本要求。

三、认证>参数

在保证检测可靠的基础上,不同仪器的下一个差异就体现在检测的灵敏度上面,这时人们关心的就是仪器能够检测到多弱的信号。

灵敏度涉及了整个光路系统的设计和选料,很难说某一个部件会起决定性作用。但是有一点,在各种单功能检测项目中,光吸收检测用非放大型的光电二极管、荧光检测用光电倍增管、发光检测用专门设计的单光子计数光电倍增管,这三种不同的检测器是各自检测领域的优先选择。

各单项检测的最优结果都是用相应检测器完成的。当然也有的仪器出于成本等考虑,用一个检测器兼容多种检测模式,这在一定程度上也能完成实验需求,但是在性能上也会有所牺牲折中,无法实现各项检测都达到最优化。

关于灵敏度的定义和检测标准,每个厂家都有各自的描述,都会说自己是怎样怎样好,很难有一个直观的客观比较。因此,某些试剂厂家就站了出来,对某些仪器的检测性能提供一个第三方的认证。

比较常见的是发光检测领域里面的Promega公司DLReady认证,荧光检测领域的 Invitrogen公司的LanthaScreen系列认证、Cisbio公司的HTRF认证、BellBrook实验室的Transcreener认 证等等。这些认证主要是针对公司提供的某一类型的要求较高的试剂盒,涵盖了对检测仪器的各种性能要求,包括:检测方法是否能用,灵敏度、线性范围、孔间干 扰等是否满足要求等等。

如果需要做相关的实验,例如做Luciferase发光检测的就看看仪器是否有DLReady认证、做 TR-FRET的就看看HTRF认证、做FP就看看Transcreener认证,如果机器拥有相关的认证,就可以说明该机器在一定程度上能够较好地满足 类似检测的各种需求,远比单单比较一个灵敏度参数更能说明问题。因为一个实验能否做好并不是单单一个灵敏度就能表征的。

需要特别注意的是,LanthaScreen是一个系列的认证,涵盖了FI、FRET、TRF、FP等多个子项目,不同仪器所通过的子项目是不一样的,需要上Invitrogen网站仔细查询核对。

光栅型的仪器由于新技术近几年才逐渐兴起,受限于技术研发和仪器成本,同一个价格范围内的灵敏度等指标会略 差于发展成熟的滤光片机器。所以,在中档多功能酶标仪领域,拿到了各种认证的光栅型仪器并不多见。而作为新一代光栅型酶标仪的代表作,TECAN M1000已经拿到了全部上述四种认证,而且在灵敏度等单项性能上也已经超越了不少的中高端滤片型酶标仪。

这说明了光栅型酶标仪的研发又进入了一个新的高度,除了在灵活性上取得了无可替代的作用外,还在检测灵敏度等方面也逐渐替代传统的滤光片型酶标仪。光栅型是科研领域多功能酶标仪的未来主要发展趋势;而滤光片型仪器也正在往单项性能更优的方面改进。

四、比色杯+微量检测

除了常规的6~384/1536孔酶标板检测之外,有些仪器还附带了比色杯、微量检测板等的兼容功能。无论 是使用立式比色杯、卧式比色杯还是各种微量检测板,其目的都是给光程不固定的酶标板检测引入一个标准光程的概念。虽然酶标板检测也能通过光程校正等方式实 现10mm光程OD值的换算,但这只是一个数学转换过程,检测误差累积较多,实际使用效果不佳。引入比色杯和微量检测板后,光吸收的检测光程就被固定在 10mm或者0.5mm等的标准长度,OD值换算更加简单和准确。附带了此类检测功能的酶标仪,相当于除了本身的多功能酶标检测之外,还能替代部分分光光 度计的功能,使其功能更加全面,仪器的性价比更高。

五、品牌与售后

不同品牌的仪器往往性能侧重点有所不用。例如,PE公司由于在试剂领域有较深底蕴,他们的酶标仪在配合使用 他们的TRF系列检测试剂盒上作了多项优化,因此PE的酶标仪普遍来说在TRF领域会有较多的特色功能和相对较高的性能指标。而像TECAN,就把研发的 重点放在了四光栅的研究方面,近年来相继推出了第二和第三代光栅型多功能酶标仪(M200、M1000),成为四光栅酶标仪领域的领头羊。而像多功能酶标 仪上加入比色杯、微量检测板等功能也是TECAN从用户角度考虑作出的技术创新,后来此类技术都成为了Thermo、BioTek等品牌纷纷仿效的对象。

最后,无论是一台多好的酶标仪,脱离了良好的售后服务体系也是难以正常运作的。今年,各家厂商都在中国国内 设立了办事处甚至亚太区总部,有些产品还专门研发了中文版的软件和说明书。这都说明了厂家对中国市场的重视。而正因为这种重视,无论是厂家直销还是选择代 理分销,都会对国内的售后服务提出各自的要求和期望,最基本的就是普及仪器的应用工程师和维修工程师网络体系。

可以说,国内的各大城市里面,基本已经做到了部分品牌总有一个工程师在你身边。选购之前多与工程师交流,充分了解各家的性能特长和售后情况,反复对比,总能找到最适合自己需要的一款多功能酶标仪。


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