如何自建方法测试Orbitrap整机灵敏度

——LC-LTQ Orbitrap XL整机灵敏度的测试

一、测试目的及标准物质确定

　　LC-LTQ Orbitrap为一台液相色谱-组合质谱联用仪，其中，LTQ为线性离子阱质谱，Orbitrap为静电场轨道阱质谱，是一高分辨质谱。由于Orbitrap也是利用傅立叶变换技术将离子的振幅转换成m/z，因此，现在也将该仪器划在傅立叶质谱仪类。

　　仪器公司所给Orbitrap灵敏度验收指标，是用仪器测试液中3个化合物特征离子的信噪比（S/N）判定是否通过验收，即：

　　咖啡因 m/z 195.0876 S/N ＞ 40

　　MRFA m/z 524.2649 S/N ＞ 40

　　Ultramark 1621 m/z 1121.9970 S/N ＞ 40

　　测试条件：注射泵进样，进样速度为5µL/min。测试液中咖啡因含量为20µg/mL，MRFA含量为13µg/mL，Ultramark为一混合聚合物（就某一个组分而言没有准确的量）。

　　而整机的灵敏度（即：使用液相色谱，过色谱柱，也称on column灵敏度），公司没有验收指标，目前国内对这类型仪器也还没有相关的灵敏度计量规程。但是，我们实验室主要做食品中残留物的分析，对灵敏度非常关注。而且在日常使用时仪器肯定是要连LC整机使用的，所以，测定仪器的整机灵敏度对实验室而言更具有实际意义。

　　选择标准物质

　　通常仪器公司提供的液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）灵敏度指标多是用利血平作为标准物质，使用Loop环、流动相进样某一定量（如1 pg）的标准物质，测定获得的信噪比，如：1pg利血平S/N ＞ 100。但现在也有公司用磺胺二甲嘧啶作为衡量仪器灵敏度的标准物质。在实际工作中磺胺二甲嘧啶是我们实验室的一个检测项目，而且在日常实验中也发现该物质的化学性质比较稳定。因此，作为实验室仪器自检规程的一个测试指标，确定了磺胺二甲嘧啶为衡量仪器整机灵敏度的标准物质。

二、测试方法

1.标准品

　　标准品：磺胺二甲嘧啶（SIGMA-ALDRICH公司，美国）。

　　标准储备液：准确称取10mg磺胺二甲嘧啶标准品用甲醇定容置10mL容量瓶中，配成1mg/mL储备液。-18℃冰箱保存。

　　仪器测定标准液：取标准储备液，用水逐级稀释至200pg/mL测试液。现用现配。

2.仪器条件

(1) 液相色谱条件

　　色谱柱：Xterra MS C18 2.1mm×150mm，3.5µm（Waters公司，美国）；

　　流动相：组分 A相 0.1%甲酸水，组分 B相 0.1%甲酸乙腈；

　　梯度程序：

　流动相流量（µL/min）：200；

　进样量（µL）：10。

(2) Orbitrap条件

　　离子化方式：ESI+；

　　扫描范围：m/z 220 ~ 320；

　　分辨率：60000；

　　毛细管温度（℃）：300

　　（以下参数为仪器自动Tune优化得到的）

　　壳气（Sheath Gas Flow）：40.00

　　辅助气（Aux Gas Flow）：5.00

　　毛细管电压（V）：25.00

　　聚焦电压（Tube Lens V）：60.00

3.测试步骤

　　(1) 仪器Tune优化：开启LC，打开Scan查看液相本底较强离子，选择与磺胺二甲嘧啶准分子离子（M+1，m/z 279.0904）接近的离子作为优化的目标离子（本实验选择的优化离子 m/z 279.2）；

　　(2) 设定仪器LC、Orbitrap参数以及序列表，进样；

　　(3) 采集、处理数据。

三、测试结果及评价

　　按照上述实验得到最终结果如图1，数据经过平滑（5次）最终得到的S/N=43（RMS）。由于基线太平直，无法得到峰-峰比的S/N。　　

图1 柱上2.0pg磺胺二甲嘧啶选择离子（m/z 279.0904）色谱图（登录状态下点击图，会看到更大的图）

　　由图可以看出，LTQ Orbitrap的绝对检测灵敏度与三重四极（QqQ）质谱的MRM检测方式相比要差几十倍，但与四极-飞行时间质谱（Q TOF）相比还是要高些，Q TOF的绝对检测量起码要几十个pg以上。但当采用高质量精度离子提取时，由于高选择性较好地滤去了基质干扰，所以可以采用加大取样量方法来提高方法的检测灵敏度。实验证明，加大取样量5-10倍，用精确质量数提取离子后本底依然很干净，且定量重现性也比较好。因此，最终的检测灵敏度与QqQ比相差应该在一个数量级以内，基本上可以满足1ppb以上检测限的项目，能否再往下做还有待在今后的工作中挖掘。

四、对灵敏度的新认识

　　通过对Orbitrap仪器检测灵敏度的测试，对现在仪器标称的S/N越来越高又有了一些新认识。从仪器S/N的表示式可知，提高分子（S）的值，或是降低分母（N）的值都可以提高S/N值。

　　提高分子（S）的值就是增加到达检测器的离子数量。仪器公司为提高检测离子的数量主要对离子源离子化和离子导入做了改进。如前些年AB Sciex公司的离子源采用Turbo V设计，加了两路加热的氮气，提高了离子化效率，见图2。后来其他公司也都对离子源的设计进行了改进。但不管那家公司的那种设计，目前离子源的离子化效率仍不超过30%。在这方面还有工作可做。　　

图2 Turbo V离子源（登录状态下点击图，会看到更大的图）

　　另一个提高S的办法是加大离子导入锥孔的孔径。这个非常好理解，孔径大了进去的离子自然多。但这种设计对仪器的真空系统提出了更高要求，为保证仪器的真空度，就需要更大的分子涡轮泵，从而提高了仪器的制造和使用成本。所以，这个孔径也不可能无限加大。

　　现在仪器厂商更喜欢做的是降低分母（N）的值——降低背景噪声。相对提高S要做的硬件改进，降低N时仪器所做电路改进增加的成本要低些。现在各仪器公司陆续推出的离轴离子传输、双离子漏斗，以及分析器的90°、180°偏转，都是为了达到这个目的。其结果是检测灵敏度值标称的越来越高，但实际达到检测器的被测离子的数量并没有增加。所以，当仪器标称100fg 利血平S/N≥500时，你若推测 10fg 应能够得到S/N≥50，那可能会让你失望。因为检测器已经检测不到足够的离子数而只能得到一条基线了。比如用Orbitrap的精确质量数提取色谱图，由于高分辨而几乎没有噪声，2pg磺胺二甲嘧啶可以得到的S/N无穷大，见图3，然而你进样量降到200fg，你只能看到一条笔直的基线。

图3 柱上2.0pg磺胺二甲嘧啶选择离子（m/z 279.0904）色谱图。（登录状态下点击图，会看到更大的图）

　　数据未经过平滑。

　　所以，我认为现在仪器的检测灵敏度指标可以这样理解，如100fg 利血平S/N≥500，基本上仪器的绝对检测量就是100fg。因而，建议大家在选择仪器时不要只盯着灵敏度这一个指标，稳定性、重现性、线性、抗污染性、易操作、软件界面友好等都应该考虑。有条件的话，最好用一个实际样品到各家仪器上做一下，除了抗污染性当时看不出来以外，其它的还是可以得到的，对比后再做定夺。此外，对用户（直接操作者）调研也是一个很好的信息通道。

注：还有几个概念稍微啰嗦几句，希望大家可以更好地理解：

“加大取样量”是指加大被测样品的称取量。分析测试百科网h"g"Q3KY:@.pjM.k
这里有一个概念要区分清楚，

“仪器灵敏度”，这是一般仪器公司所给。
J(p"OIlDv0这个灵敏度是注入仪器标准品绝对量得到的。

“方法灵敏度”，这是一个分析方法所能获得的最低检出限。分析测试百科网,gn0@:}v IY5I
这个灵敏度是要考虑方法所称取样品量的。

举个例子：

仪器灵敏度所得磺胺二甲嘧啶灵敏度2pg S/N=43。分析测试百科网+v QM)J
Dm^Dr
2pg可以视为仪器能够检测的绝对量。

当实验室时取1g样品，最后定容到1mL，则1mL就相当1g样品。分析测试百科网 W#t"KF0T
若进样10uL，0.2ng/mL（0.2pg/uL）的含量即可检出，分析测试百科网B"d5d.a?5bA
折算到样品里，就是0.2ng/g，可以说方法检出限0.2ppb。

若开始取5g样品，最后定容到1mL，则1mL就相当5g样品。
C)Kmq)u1u3?0定容后还是 0.2ng/mL（0.2pg/uL），分析测试百科网4cOWz eF
但这时折算到样品里，就是0.2ng/5g=0.04ng/g，
j[t"j1o/P8R+z0那方法检出限就是0.04ppb。

上文中所说的“加大取样量5-10倍”，分析测试百科网l/nJ
b6P1yK6A@ I
就是指比正常分析时多称取5-10倍的检测样品量。