外伤后细菌性致死性肉芽肿的透射电镜观察

上一篇 / 下一篇 2010-07-01 11:42:54

　　作者：高天文，李春英，廖文俊，刘健

　　中图号:R754.9

　　摘要:目的外伤后细菌性致死性肉芽肿是一种尚未被认识的新疾病，近20a来在我国多个地区已发现20余例，无一存活.本研究应用透射电镜寻找病原体，为该病的诊断和治疗提供线索. 方法以透射电镜观察2例外伤后细菌性致死性肉芽肿的活检组织，寻找该病的病原. 结果病变组织内主要为组织细胞、多核巨细胞，细胞内有大量溶酶体样结构，部分溶酶体样结构具有“杆菌”形态，另见少数球菌.根据电镜下的发现成功分离出1种严格的厌氧性细菌，初步确定为放线菌，并根据细菌药敏结果救活了1例患者. 结论对于怀疑由病原体所致的疾患，电镜下发现损害中的病原体是最具说服力的证据，本病的发现和命名，电镜发挥了关键作用.

　　Observation of fatal bacteria granuloma after trau┐ma on transmission electron microscopy

　　GAO Tian-Wen，LI Chun-Ying，LIAO Wen-Jun，LIU Jian

　　Center of Dermatology&Venereology of Chinese PLA，Xijing Hospital，Department of Electron Mi-croscopy，Faculty of Preclinical Medicine，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China

　　Keywords:granuloma;microscopy，electron;bacteria，anaerobic

　　Abstract:AIM Fatal Bacteria Granuloma after Trauma is a new kind of disease that has not been recognized.More than20cases of the disease have been noticed in China during the past20years.No patient had been saved till recently.The aim was to probe into the pathogen of the disease and save the patients'life.METHODS Tissues from the lesion of pa-tients were observed through electron microscopy.RESULTS There were a lot of histocytes and multinuclear giant cells in the lesions.A great quantity of lysosome-like structure was observed in multinuclear giant cells and histocytes.A part of lysosome-like structure was supposed as bacteria.Besides coccus，a kind of anaerobic actinomycetes was isolated with anaerobic culture according to the finding of electron mi-croscopy.The patient was saved on the base of the result of medicine sensitive test of bacteria.CONCLUSION It is the most convinced proof to find pathogen on electron microscopy for the diseases suspected due to pathogens.The electron mi-croscopy plays a key role in the finding and naming of the dis-ease.

　　引言

　　一种于外伤愈合后形成的皮肤肉芽肿系尚未被认识的新疾病，近20a来在我国多个地区已发现20余例，其组织病理、临床过程基本相同.由于其临床的基本改变为结节，组织病理基本上为组织细胞浸润，故按结节病进行治疗，患者全部在1.5～4a内死亡.1996年我们诊治第1例，通过透射电镜发现其病原为细菌，从形态看有球菌及“杆菌”.细菌培养确定了其中的球菌为表皮葡萄球菌，但3次厌氧及需氧培养均未能分离出电镜下所见的“杆菌”.使用对表皮葡萄球菌敏感的抗生素治疗未能挽救患者的生命.通过认真分析上例中杆菌分离失败及其他学者均未能分离出细菌的原因，认为“杆菌”可能为严格厌氧菌[1] .依据上述分析和思路，1999年在另1例患者皮损中分离出病原菌，并依据分离出的细菌药敏结果成功挽救了患者.电镜观察在本病的确定中起了关键作用，我们特予叙述和讨论.

　　1 材料和方法

　　1.1 组织来源

　　例1，60岁男性农民.以额部外伤0.5a，伤愈后出现斑块5mo就诊.患者0.5a前擦伤额部，20d后自愈.伤口愈合后逐渐出现斑块，约5mo后，左耳后出现斑块，继之右耳后亦出现皮损，无明显不适.就诊时额部见9cm×7cm×0.5cm暗红色斑块，大斑块边缘有孤立的丘疹及小斑块;左耳廓后有3cm×1.5cm×0.2cm斑块，中央略萎缩(Fig1)，右耳后亦见小的皮损，拟诊:结节病.组织病理见真皮内弥漫的炎性浸润，浸润细胞主要为组织细胞，并见少数浆细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及多核巨细胞，未见坏死组织.组织片PAS染色及抗酸染色均为阴性.左耳后及右耳后皮损基本改变与额部皮损类似.免疫组化示95%以上的浸润细胞及全部多核巨细胞胞质内CD68 呈强阳性(Fig1)，CD20 及CD3 阳性细胞小于1%.植物凝血素(PHA)及结核菌素(PPD)皮试均阴性，其余各项实验室检查无明显异常.头部X片示骨质无异常.3次组织匀浆细菌培养2次分离出表皮葡萄球菌，普通厌氧培养3次未分离出细菌.根据表皮葡萄球菌药敏试验结果用阿莫仙等未控制病情，后期出现表情淡漠，反应迟钝，剧烈头痛，拒绝入院治疗而死亡，自出现斑块至死亡全程13mo.例2，男性，45岁农民，以右眉弓外伤1a，伤愈后出现斑块6mo就诊.就诊时一般情况好，右眼眶旁、颞部及下颌角见5个类圆形暗红色浸润性斑块，最大斑块约3cm×2cm×0.3cm，界清，表面光滑(Fig1).组织病理、免疫病理与例1相同.PHA(-)，DDP()，血沉30mm/h、血常规WBC2.4×109 ・L-1 ，其余各项检查无异常发现.皮损组织匀浆细菌培养分离出头状葡萄球菌，严格厌氧条件下有细菌生长，涂片染色为革兰阳性，其形态、大小不一、染色不均，多为杆菌形态，约0.3μm×1μm，排成链状、分枝状，少数革兰染色强阳性，粗而长，可达10μm(Fig1f)，初步确定为一种特殊的放线菌.药敏试验:厌氧菌对灭滴灵不敏感;泰能、林可霉素、头孢西丁、万古霉素敏感.头状葡萄球菌对青霉素及红霉素不敏感，头孢类、其他抗生素及万古霉素均敏感.单用林可霉素8mg，im，3次・d-1 ，5d后1皮损中央出现结痂，治疗3mo后皮损基本消退，5mo后停药观察，至今停药已18mo，患者一般情况良好，未见复发.

　　图1 a:额、颞及左耳后斑块;b:组织病理，真皮网状层密集的炎性浸润，主要为组织细胞，多核巨细胞较常见;c:皮损免疫组化示多数浸润细胞、多核巨细胞胞质内CD68 呈强阳性;d:就诊时皮损;e:组织病理，真皮网状层密集的炎性浸润，主要为组织细胞;f:在严格厌氧条件下从皮损中分离出的分枝状细菌(略)

　　Fig1 a:There were plaques on the forehead，temple and behind the left ear.b:Histopathology shows intensive diffused infil-tration of histocytes in the dermis;there were many multinuclear giant cells among infiltration.c:Most infiltrated cells and all of the multinuclear giant cells were strong positive for CD68 .d:There were plaques in the face while patient visited our;e:Histopathology shows intensive diffused infiltration of histocytes in the dermis;f:Ramose bacteria was identified with strict anaerobic culture

　　1.2 电镜标本制作及观察

　　两例均先后4次在无菌条件下手术切取组织，第一次切取的组织仅做组织病理，其后每次分为5块分别作组织病理、真菌培养、需氧细菌培养、厌氧细菌培养及电镜.依据每次组织病理所见类同，两例最终制作电镜标本的组织均为第二次手术切取的皮损.分别切取表皮及真皮上部、真皮中部、真皮下部，切成约1mm×1mm×2mm大小，以30mL・L-1 戌二醛缓冲液固定，1mL・L-1 锇酸后固定，环氧树脂包埋，制成半薄切片进行定位，然后制成超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅染色，以JEM-2000EX电镜观察.两例均先后2次选不同的包埋块制作超薄切片进行观察，共观察包埋块6个.

　　2 结果

　　先后观察的6个包埋块所见基本相同.

　　2.1 细胞成分

　　主要为组织细胞，另可见多核巨细胞、浆细胞，偶见中性粒细胞、淋巴细胞、坏死细胞(Fig2).组织细胞及多核巨细胞胞质内见大量溶酶体样结构(Fig3).

　　图2 多核巨细胞(MN)、组织细胞(H)、淋巴细胞(L)、浆细胞(P)、坏死细胞(D)，坏死的细胞内有残留细胞器.Fig2c中有可疑的球菌(C)及杆菌(B)(略)

　　Fig2 Pictures show multinuclear giant cells(MN)，histocytes(H)，lymphocyte(L)，plasmocyte(P)，necrosis cell(D).There are organelles in the necrosis cell.The coccus(C)and bacilli(B)can be seen in the Fig2c

　　图3 多核巨细胞(a)及组织细胞(b)内均有大量溶酶体样结构(略)

　　Fig3 There are a lot of lysosome-like structures in the multinuclear giant cells(a)and histocytes(b)

　　图4 典型的球菌(a)及杆菌(b)Fig4 Coccus(a)and bacilli(b)(略)

　　2.2 细菌

　　第一次观察时主要注意到少数细胞内有典型的球菌(Fig4a)，并发现一典型的细胞外杆菌(Fig4b)，未发现真菌、病毒颗粒及其他病原体.对多核巨细胞及组织细胞中的溶酶体样结构反复观察分析，发现大部分具有杆菌的特点，多为双层膜结构，有空泡，大小0.3μm×1μm(Fig5a～g)，少数直径约2μm(Fig5m～o)，有缺少界膜呈空泡状的核区;细胞质膜多较清楚(Fig5a～p)，由二个电子致密层与一个电子透明层构成，厚度5～10nm(Fig6);细胞壁仅见于一个细菌中，基本结构为二个电子致密层与一个电子透明层，厚度不均，约30～60nm(Fig6).

　　图5 多核巨细胞及组织细胞内的溶酶体样结构中，部分具有典型的细菌形态，有核区;细胞质膜多较清楚(略)

　　Fig5 Part of lysosomoid structures in the multinuclear giant cells and histocytes show typical bacilli form.There are nuclear area and clear cytoplasmic membrane in most of them

　　3 讨论

　　对于怀疑由病原体所致的疾患，电镜下发现损害中的病原体是最具说服力的证据.此类病例中，多位学者曾认真进行过细菌分离等探讨，但一直未能找到病因及挽救患者的生命.我们第一次采用透射电镜对该病进行观察，找到了病原菌，虽然第一例患者仍未能被救活，但电镜下观察到当时认为的“杆菌”，并依据此发现推断以往反复细菌培养均未获得成功可能是该菌为严格厌氧菌，为此进行严格的厌氧培养并分离出病原及救活了患者，即电镜观察为该病确定奠定了非常重要的基础.

　　行电镜观察的两个病例中，均找到了球菌，细菌分离培养第1例每次均为表皮葡萄球菌，第2例为头状葡萄球菌.表皮葡萄球菌及头状葡萄球菌均系凝固酶阴性的葡萄球菌，易于分离培养.以往的研究者均未获结果，其失败原因有三种可能:一是细菌培养前应用抗生素使其被杀灭;二是我们的两例患者均碰巧伴有混合感染，其他的为单一感染或伴有另外的细菌感染;三是此类葡萄球菌为最常见的污染菌，检验人员将其视为污染菌未予报告，因为我们的第一例中曾发生过此种情况.各种凝固酶阴性的葡萄球菌在患者抵抗力低下时可以作为一种条件致病菌造成化脓性感染，因其对多数抗菌素敏感，易于治疗.本病的皮损从不发生化脓，使用对分离出的葡萄球菌敏感的抗菌素未能挽救患者的生命，提示致患者死亡的细菌不是它，而是厌氧性放线菌.葡萄球菌或许在本病中的作用只是消耗氧，为厌氧菌的生长创造条件.

　　图6 Fig5局部放大，示细胞壁(空十字)有2个电子致密层与1个电子透明层，厚度不均，约30～60nm.细胞质膜(弯箭头)也由2个很薄的电子致密层与1个电子透明层构成，总厚度约10nm(略)

　　Fig6 It is local magnification of Fig5to show cell wall(empty cross)，which consists of2electron-dense layers and1electron-lucent layer.It is uneven in thickness.Cytoplas-mic membrane(curve arrow)also consists of2electron-dense layers and1electron-lucent layer but much thin

　　依据电镜提示分离出的厌氧菌，根据其形态特点、生化分析、药敏结果及请教中国科学院微生物研究所的放线菌专家，初步确定为放线菌，并按药敏结果成功救活首例患者(另文).目前许多皮肤病学中仍将放线菌病归在真菌感染类内[2-4] ，但放线菌为细菌的一个目，已分出53个属、数千个种，至少有11个属可致放线菌病[5] .放线菌为兼性厌氧菌，本病中分离出的细菌为严格厌氧菌，分离极其困难，另外本病的临床特点及病理改变不同于目前已知的各种放线菌病[3，4，6] ，并能除外结节病[1，7，8] 、非典型分枝杆菌病[9-11] 等几种相似疾患，故认为系一种新的疾病[2] .细菌培养涂片见分离纯化的放线菌形态、大小不一，染色不均，多为杆菌形态.由于细菌存在于吞噬细胞内，多数已被溶酶体酶溶解消化，电镜下所见的形态表现更为多样性，除少数可分辨出细菌外，所见主要为大小、形状多样的次级溶酶体.电镜在该病的诊断中发挥了关键作用，但电镜下所见的细菌形态不足以确定某种细菌，组织内的细菌也不能代表某种细菌的基本形态.由于细菌对厌氧条件的要求高，分离后于未能作进一步鉴定及留作电镜观察前即已死亡，纯化的细菌超微结构形态有待今后观察.

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　　第四军医大学:西京医院全军皮肤性病中心，基础部电镜室，陕西西安710033