本文介绍生物大分子印迹技术及其印迹聚合物的研究进展，其中包括对蛋白质、核酸、微生物细胞进行分子印迹所采用的印迹方法、机理以及存在的问题，最后简要探讨了生物大分子印迹聚合物在医学研究中的应用前景。
分子印迹技术(molecular imprinting
technology，MIT)是一种模拟抗体-抗原立体空间构型互补，达到特异性亲和作用的原理所开发出来的生物模拟技术。抗体-抗原决定族亲和反应的作用主要来自于抗体和抗原接触界面的紧密性。同理，以单分子为模板，单聚体与分子模板发生接触并通过诱发聚合反应，围绕分子模板形成多聚物则为分子印迹聚合物(molecularly
imprinted polymer,
MIP)。MIP就如抗体一样，能与分子模板(抗原)产生特异性亲和作用，因此可广泛应用于分离提纯，定性定量分析测定含有模板结构的物质。
这种技术是德国的Wulff首先在1972年提出，90年代开始得以迅速发展，特别是在用于分离测定有机小分子的应用上及其广泛。基于目前生物医学的研究进展，简单、快速的生物大分子如蛋白质、核酸、微生物的检测、分离与纯化的技术已经是研究基因和蛋白质功能的急需手段。MIP技术能否在蛋白质和基因晶片(microarray)中取代传统的抗体和蛋白分子技术，是对MIP技术的挑战也是机遇，在生物大分子分析中的应用还有待开发。
1 MIP制备原理及组成
1.1 MIP制备原理
将印迹分子(模板分子)与合适的功能单体混合，并使用交联剂将其聚合，在印迹分子周围形成交联度很高的三维交联的高分子聚合物网络;而后再用适当的方法将印迹的分子去除，最终得到的聚合物即为分子印迹聚合物(图1)。根据印迹分子与功能单体的结合方式可以将MIP分为两种基本类型：共价型和非共价型，前者是指单体与印迹分子间在交联聚合前先通过硼酸酯、Schiff碱、酯、缩醛以及缩酮等方式形成牢固的共价键;而在非共价印迹方式中，单体与印迹分子之间是以离子键、氢键、范德华力及疏水作用等非共价形式形成弱相互作用;后者与前者相比：由于单体与印迹分子之间形成的是一种多点协调、强度较弱的相互作用，因此它具有结合容易、解离容易、可逆性好、达到平衡快的优点[1]。
图1. MIP制备示意图[2]
Fig1. Schematic representation of molecular
imprinting
1.2 MIP组成
1.2.1 功能单体
分子印迹中功能单体应能和印迹分子特异性结合，较为常用的为甲基丙烯酸[3]和丙烯酰胺[4,5]。前者的羧基可以以离子键方式与胺发生作用，也可以以氢键方式与酰胺、羧基发生作用。后者是色谱和电泳中常用的惰性凝胶单体，适于蛋白质的分离纯化。它的酰胺功能团即使在极性溶剂中也可以形成较强的氢键，酰胺基在水溶液中不会离子化，以蛋白质为印迹分子时，蛋白质中的肽键可以和酰胺形成较强的作用力。一些天然的多糖物质如壳聚糖也被用作蛋白质印迹的功能单体，制成的血红蛋白印迹聚合物具有特异性地识别能力[6]。用多种单体来印迹蛋白质可能是一种很有前景的方法，聚合物可以增加识别作用力的种类，从而可以提高对印迹分子的选择性[7]。
1.2.2 交联剂
交联剂的作用是原位固定化功能单体，使聚合物形成一定的空间网络结构。模板分子去除后，聚合物仍保留与模板分子互补的三维孔穴，为了保证聚合物的刚性和柔性，针对不同的交联剂其用量不同，其直接关系到最终产物的交联度，对聚合物的性能有深刻的影响。常用的有双甲基丙烯酸乙二醇酯(
EGDMA)、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、环氧氯丙烷[6]等。
1.2.3 引发剂
目前的普遍采用引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)，加热60℃引发聚合，对于热不稳定的模板分子可选择低温紫外光(350nm)引发聚合;在最近蛋白质印迹研究中，多采用水溶性的过硫酸盐-四甲基亚乙二胺(TEMED)或亚硫酸氢钠的氧化-还原体系。另外，电聚合方式在电极原位聚合中以其独特优势而备受关注[8]。
1.2.4 溶剂
分子印迹聚合物合成中，溶剂对模板分子与功能单体之间的作用力影响很大，直接影响到聚合物对模板分子再结合的亲合性和选择性。基本要求是溶剂对模板分子、功能单体等各组分有较好的溶解性，传统常用溶剂有氯仿、乙腈、甲醇与水的混合液等[9]。同时为提高模板分子在聚合物中的传质速度往往在其中加入致孔剂，如甲苯、二甲苯等，以增加聚合物孔径的大小和数量，从而提高响应速度。但考虑到天然的生物分子相互作用：如酶与底物、抗原与抗体、给体与受体等大多是在水环境中进行反应的，因此最近对于生物大分子印迹聚合物的研究均致力于在水溶液中进行[10,11]。
2 生物大分子印迹聚合物制备
2.1 蛋白质分子印迹聚合物研究
1996年，瑞典大学Hjertén等[4]采用包埋法，以丙烯酰胺为单体合成了低交联度的凝胶，对血红蛋白、生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶等进行了印迹。经过含10%SDS的乙酸(10%)溶液洗脱模板分子，得到具有良好选择性的MIP，从而开启了蛋白质分子印迹聚合物研究的大门。
表面法制备蛋白质MIP，最早是将糖蛋白转铁蛋白在溶液中与硼酸酯硅烷发生作用，然后在多孔硅胶颗粒上进行聚合[12]。由于硼酸酯基团能通过酯基与糖和糖蛋白发生可逆反应,
因此硼酸酯硅烷与转铁蛋白的预结合使得硼酸酯基团能正确排列，因此保证了印迹位点对转铁蛋白的特异性。另一种表面印迹技术是在金属离子(Cu2+)和核糖核酸酶A[13]存在的情况下，利用金属螯合单体在活化的硅胶颗粒上进行聚合。由于核糖核酸酶A存在两个暴露在分子表面的组氨酸可以与两个金属螯合分子进行螯合作用，在聚合过程中金属螯合分子固定到硅胶表面并生成特异性结合部位。1999年，Shi等[14]提出了平板表面印迹方法，蛋白质首先被吸附在云母上，然后用二糖分子包在被吸附的蛋白质上，二者通过氢键结合，再在糖分子表面聚合上一层荧光聚合物薄层，最后除去云母，溶解掉蛋白质分子，就生成了具有蛋白质形状孔穴的聚二糖表面印迹聚合物。2004年，Ramanaviciene等[8]采用电聚合方法在电极表面合成牛白血病病毒糖蛋白分子印迹聚合物，并利用脉冲安培法对样品中的模板分子进行了检测。最近，李永等[15]将蛋白质固定在表面覆盖铝膜的纳米管上，以丙烯酰胺为单体，亚甲基丙烯酰胺为交联剂聚合，而后用NaOH溶解纳米管和铝膜，洗脱模板蛋白后纳米线聚合物表面则留下特异性识别孔穴(图2)，其对目的蛋白具有特异性吸附能力。
图2. 纳米线蛋白印迹示意图[15]
Fig 2. Schematic representation of the protein molecule
imprinted approach employing nano-tube
在微球表面进行蛋白印迹同样取得很大进展，南开大学郭天瑛[16,17]课题组制备了壳聚糖微球，进而对其进行化学修饰，以磷酸缓冲液为溶剂制备了血红蛋白分子印迹聚合物，对模板分子的分离效果良好，并且具有很强的特异性。Shiomi等[18]在胺基化硅胶颗粒表面引入醛基，并采用共价方法印迹了血红蛋白并对模板分子进行了分离。天津大学庞兴收等[19]采用反相种子悬浮聚合法，在磷酸盐缓冲液中利用丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺制备凝胶微球，在其表面对牛血清白蛋白(BSA)进行印迹，聚合微球对模板分子具有良好的特异性吸附能力和分离能力(分离因子α为3.54)，这些具有窄分布的球形粒子非常适合于色谱分析。
利用抗原肽制备蛋白分子印迹聚合物也有相关报道，此法是由Rachkov[20]等人在2001年提出：其原理来源于自然界中的相似方法，即抗体在识别抗原时只与抗原的小部分，即抗原表位(抗原决定基)发生作用。该法是采用与蛋白质结构中暴露在表面的肽链相同的短肽作为模板分子制备MIP，此MIP不仅可识别该肽，也可以识别整个蛋白质分子。2004年，该课题组利用该方法在水相中合成了[Sar1,Ala8]血管紧张素II的分子印迹聚合物[21]，并以高效液相色谱分离了血管紧缩素Ⅱ和模板分子SA的混合物,
考察了流动相的pH值、磷酸盐缓冲溶液的浓度、流动相中乙腈的含量对被分析物保留因子的影响。Tai等人[22]利用该方法，首先合成登革热病毒表面NS1蛋白抗原肽，以丙烯酸和丙烯酰胺为单体，采用紫外光引发聚合，在QCM电极表面制备了针对NS1蛋白的MIP，依据频率改变检测登革热毒NS1蛋白最低浓度为5ng/mL。
2.2 核酸分子印迹聚合物研究
2004年，Slinchenko等[23]首次在硅烷化的载玻片表面合成了DNA分子印迹聚合物。研究人员选取一种细菌外毒素基因双链DNA(34bp)为模板分子，以2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪(VDAT)和丙烯酰胺为功能单体，亚甲基双丙稀酰胺为交联剂，50mM的HEPES为溶剂，TEMED和过硫酸胺引发聚合获得MIP，利用荧光分析、等离子共振技术研究了模板DNA分子与MIP的作用机理，表明功能单体VDAT的胺基与暴露在DNA双螺旋外侧的A-T碱基对之间形成氢键作用，这是成功进行DNA分子印迹的基础。最近，Ogiso等[24]制备了针对特异性DNA片断的分子印迹聚合物凝胶，用此凝胶进行电泳，由于靶序列能够被MIP俘获导致其电泳迁移率和非靶序列产生差异，Ha-ras基因及其突变体核酸片断电泳结果表明能够对单个碱基突变进行识别与分离。
2.3 微生物分子印迹聚合物研究
1996年，Aheme等[25]采用李斯特菌和金葡菌为模板，在聚酰胺微球表面首次实现了对整个细胞的印迹，并用荧光凝集素对模板进行了检测。2002年，Dickert等[26]印迹了酵母细胞，首先在石英晶体微天平(QCM)电极上均匀涂布聚氨酯层，而后在其表面压制固定酵母细胞的载玻片，固定过夜后用热水洗脱模板，在电极表面形成蜂窝状孔穴(图3)，传感器检测范围为10-4～10-9细胞/ml样品;随后该课题组采取类似方法，以烟草花叶病毒(TMV)为模板，丙烯酸为功能单体，EGDMA为交联剂，AIBN为引发剂，紫外光引发聚合制备了MIP-QCM生物传感器，对感染TMV的植物叶片提取液进行检测，病毒检出浓度达到80ppm[27]。
图3. 微生物印迹示意图[27]
Fig3. Schematic representation of the microorganism imprinted
approach
2.4 生物大分子的洗脱
模板分子洗脱的效果决定了印迹聚合物的重复使用和吸附容量。目前对于蛋白质模板所用的洗脱剂可分为两大类：一类是磷酸盐缓冲溶液，Burow
等[4]用其直接冲洗MIP，认为表面的印迹蛋白质能被洗脱;另一类是用解离肽链的试剂，如蛋白酶[28]、含10 %SDS 的乙酸(10 %)
溶液[29]、EDTA
和尿素[13]等使蛋白质洗脱;Ou等则采用0.1mol/L的NaCl溶液[30]对溶菌酶模板进行洗脱，取得良好的效果。对于核酸而言，Slinchenko使用0.1M的盐酸胍对双链DNA模板进行洗脱。
3 生物大分子印迹面临的挑战
3.1 生物大分子印迹机理
对于蛋白质等生物大分子来说，其功能结构其为复杂。蛋白质的空间构型和侧链的氨基酸功能机基团如丝氨酸的羟基，酪氨酸得苯酚环，赖氨酸的氨基，半胱氨酸的巯基都给MIP技术带来了许多不可预测的因素。蛋白质的构型在聚合反应的条件和过程中可能发生改变，从而使获得的MIP与模板蛋白不匹配以至失去亲和作用。
对于生物大分子的印迹，其识别作用力应是数目众多的遍及介质的较弱作用力，这些弱的相互作用包括氢键、电荷转移、微弱的诱导偶极作用和非极性作用等。蛋白质和其他许多生物大分子都带有许多带电或非极性的基团，这些基团可以和介质形成离子作用或疏水作用。而且由于蛋白质和其它大分子具有许多可结合位点，使得印迹聚合物中印迹位点与蛋白质结合的作用力得到加强。另外生物大分子不同于小分子那样容易扩散接近印迹位点，其有效印迹位点可能是位于MIP表面或孔道的表面，而在聚合物网络里包埋的部分蛋白质却无法被洗出来。所以理想的MIP应具有足够的作用力保证蛋白质的选择性吸附，还应具有一定孔径分布，确保足够的有效印迹数量和较小的印迹分子扩散阻力。
3.2 单体
MIP技术的制备方法简单，但是设计及制备技术却需要对生物与多聚化学的深厚基础。MIP技术在分析某一个具体生物大分子的成败，决定于对该分子结构的了解和对根据反应特性对聚合条件进行选择。首先单体必须有特异的功能团可以与模板分子紧密接触(范德华力，疏水作用)形成离子键、氢键的能力，同时具有能被有效可控诱发多聚化的功能团(如亲核碳原子，自由基敏感基团)。另外蛋白质等大分子进行印迹的单体应该比小分子印迹聚合物的单体更为惰性，否则很容易造成非特异性吸附。合成发光功能单体对于分子印迹聚合物的应用更具有重要意义。
3.3 洗脱液
生物大分子由于其特有的结构，从而导致容易变性失活。在进行分子印迹的过程中保持其活性也是至关重要的，因此寻找温和有效的洗脱方法也是目前该领域的一个亟待解决的问题，如果吸附的印迹分子无法被洗脱并保持其生物活性，则对于比较昂贵的蛋白质分子印迹技术的发展就会受到很大的限制。
4 生物大分子印迹聚合物的应用
4.1 分离纯化领域的应用
生物大分子印迹聚合物能广泛用于色谱固定相以及固相萃取技术。如血红蛋白在胆红素和许多酶的测定中有干扰作用，而以血红蛋白为印迹分子的MIP可在不同溶液中除去血红蛋白分子。最近，赵卓[31]用克隆表达的猪细胞溶质蛋白(pCyP18)为模板分子，在硅胶颗粒表面制备MIP，而后将其与细胞提取物共混合，对靶蛋白富集效果达300倍。MIP对模板分子的高效识别作用还可以用于药物的分离和分析，能有效的在数以万计的药物中筛选出含有特殊功能的药物分子。
4.2 模拟抗体
利用蛋白质分子印迹聚合物制备的模拟抗体可代替天然抗体用于免疫分析中，这样可不需要用于制备抗体的实验动物及相应的免疫技术。另外，天然抗体难于回收再利用，而模拟抗体制备较为简单，并且性质稳定，能够抗机械作用、高温、高热、耐受酸、碱，因此可重复利用。Tai等制备的登革热病毒NS1蛋白分子印迹聚合物用作第一抗体，结合抗原以及第二抗体用于免疫测定取得了良好的效果[22]。
4.3 生物传感器
以生物大分子为印迹分子制备的MIP能够取代传统生物活性组分，作为生物传感器的特异识别元件，MIP对分析物产生的结合可通过转换器做出快速反应。这样制备的生物传感器除了具有传统生物传感器的优点外，还有制作成本低、耐受性高、寿命长等优点,
可大规模应用。本课题组严守雷等[32]已经成功构建了丁酰肼分子印迹聚合物生物传感器，对模板分子检测效果良好。2005年，姚守拙课题组在QCM电极表面制备了人血清白蛋白的MIP，构建了MIP-QCM生物传感器，并考察了反应体系溶剂、温度、pH等条件，实现了对混合样品中模板蛋白的检测[33]。
尽管对于生物大分子印迹聚合物的研究工作开展较晚，但在短短几年中，其制备和应用研究已经取得了一定进展，生物大分子印迹聚合物研究在今后的生物、医学、环境及卫生检测研究领域必将大有作为。
分析化学 仪器分析 红外光谱
