单分子检测技术的关键（节选，涂熹娟 B200425010 发光分析）

单分子检测技术的关键将荧光基团标记在生物大分子上，可以通过其各种特性的变化来反映有关分子间的相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境下活性改变等信息。并且标记上去的荧光团对宿主的性质影响很小。在稀溶液中，吸光光度法检测单个分子的吸光值的准确度较低，而荧光发射检测因背景值较低，所以较为灵敏，信噪比较高。正如Keller所说“单分子检测能力的高低与其说是检测灵敏度的提高，不如说是背景噪音的降低”对单分子荧光的探测必须满足两个基本要求:：（1）在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用，这一点可以很方便地通过调整研究体系的浓度（密度）来达到;（2）确保单分子的信号大于背景干扰信号。可以通过减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰来达到。杂散光背景是影响单分子荧光检测信号的重要因素。为了有效地检测单个分子，必须大大降低杂散光的干扰。背景杂散光的主要来源为：溶液瑞利散射光、拉曼散射光和光学器件的散射光。单分子检测在降低由瑞利散射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰时，因为单分子信号与探测体积无关，而背景则正比于探测体积，所以为减少单分子检测时背景杂散光的干扰，采用了降低探测体积这一有效途径。因此，要获得理想的信噪比需要将激发体积最小化。目前文献报道的流体聚焦法的检测体积可达到1～10pL的级别；微滴法也可达到pL级，共聚焦显微法的探测体积则在fL至亚fL级，因此背景可忽略不计，具有很高的信噪比，但这种方法由于布朗运动导致分子进入探测区域的概率较小，使得分子检测的效率较低。如何平衡检测体积的减小与检测效率的提高亦是单分子检测技术亟待解决的问题之一。另外，还有人使用毛细管和微通道来达到降低检测体积的目的。为了消除杂散光，还可以采用的方法：(a)光谱滤波：有滤光片去掉其它颜色的杂散光（如瑞利散射光，光学器件散射光，溶液杂质的荧光）；(b)利用荧光和杂散光在时间特性上的区别来消除拉曼散射光。由于荧光强度是一条指数衰减曲线，荧光发射有几个ns 的延迟，因此采用高重复频率的激光器并结合时间门符合技术可以把单个染料分子的荧光信号同很强的背景杂散光区别开来。