单分子检测技术的关键(节选,涂熹娟 B200425010 发光分析)

上一篇 / 下一篇  2010-07-16 10:39:14

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单分子检测技术的关键将荧光基团标记在生物大分子上,可以通过其各种特性的变化来反映有关分子间的相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度及在化学和静电环境下活性改变等信息。并且标记上去的荧光团对宿主的性质影响很小。在稀溶液中,吸光光度法检测单个分子的吸光值的准确度较低,而荧光发射检测因背景值较低,所以较为灵敏,信噪比较高。正如Keller所说“单分子检测能力的高低与其说是检测灵敏度的提高,不如说是背景噪音的降低”对单分子荧光的探测必须满足两个基本要求::(1)在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用,这一点可以很方便地通过调整研究体系的浓度(密度)来达到;(2)确保单分子的信号大于背景干扰信号。可以通过减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰来达到。杂散光背景是影响单分子荧光检测信号的重要因素。为了有效地检测单个分子,必须大大降低杂散光的干扰。背景杂散光的主要来源为:溶液瑞利散射光、拉曼散射光和光学器件的散射光。单分子检测在降低由瑞利散射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰时,因为单分子信号与探测体积无关,而背景则正比于探测体积,所以为减少单分子检测时背景杂散光的干扰,采用了降低探测体积这一有效途径。因此,要获得理想的信噪比需要将激发体积最小化。目前文献报道的流体聚焦法的检测体积可达到1~10pL的级别;微滴法也可达到pL级,共聚焦显微法的探测体积则在fL至亚fL级,因此背景可忽略不计,具有很高的信噪比,但这种方法由于布朗运动导致分子进入探测区域的概率较小,使得分子检测的效率较低。如何平衡检测体积的减小与检测效率的提高亦是单分子检测技术亟待解决的问题之一。另外,还有人使用毛细管和微通道来达到降低检测体积的目的。为了消除杂散光,还可以采用的方法:(a)光谱滤波:有滤光片去掉其它颜色的杂散光(如瑞利散射光,光学器件散射光,溶液杂质的荧光);(b)利用荧光和杂散光在时间特性上的区别来消除拉曼散射光。由于荧光强度是一条指数衰减曲线,荧光发射有几个ns 的延迟,因此采用高重复频率的激光器并结合时间门符合技术可以把单个染料分子的荧光信号同很强的背景杂散光区别开来。

目前用于单分子研究的技术很多,包括观察其构象的变化、功能活动,以及与其它分子相互作用的动力学过程,可揭示出过去检测多分子集体行为平均化所掩盖的“个性”和蕴藏的丰富信息,从而深入了解生命活动的微观规律。可将其归纳成以下两个方面:扫描探针技术和光学和光谱技术。在扫描探针技术中,主要有扫描隧道显微技术(SEM)、原子力显微技术(AFM)和扫描离子电导显微镜技术(SICM)等相似技术家族。而在光学和光谱技术中,则包括了扫描近场光学显微技术(SNOM)、光钳技术(OT)和荧光技术(Fluorescence)。而且现在根据需要,还发展出各种组合技术,如AFM/光钳、SNOM/共焦显微术、SNOM/FRET等。STM 利用针尖与样品在近距时的隧道电流,AFM 利用针尖与样品直接接触时的力,SICM 利用针尖与样品间的电导达到成像的目的。由于这类技术可在常温常压下进行,而且分辨率很高(10-9-10-10m 水平),因此对于显示单个分子的形貌具有很大的优越性。目前应用AFM 比较普遍,它不仅可以观察处于溶液状态的单个分子,更接近于生理状态,而且可以测量力谱,即和大分子一部分接触,并通过施力与距离的关系了解分子的力学性质,特别适合于对生物分子折叠与解折叠的研究。各种形式的扫描探针显微技术较常规的光学显微技术有更高的空间分辨率,但在获得高分辨的同时,这些方法却失去了光学显微技术的许多优点,如:对试样的无损伤性,试样能置于空气分析,仪器设备价廉、易操作、分析精度高、速度快等。尤其是前三种优点使光学显微技术具有强大的生命力和吸引力。在单分子检测的光学和光谱技术中,扫描近场光学显微技术能够获得超过光学衍射限的超高分辨。扫描近场光学显微技术的近场是指光源与样品间的距离接近到纳米水平,而且光源通过针孔甚至光纤的尖端加以限制,以致通常光学显微镜因为光的衍射现象而受光波波长的限制被打破,分辨率不再决定于波长,而由光源尺寸和光源-样品的间距决定,因而可以达到几十纳米的分辨率。光钳技术是利用激光通过透镜后产生的力场,使样品因形成偶极子而在力场作用下聚集于焦点的办法来操纵分子。光钳对微粒的操纵不是刚性的,而是像个弹簧,可以在操作过程中实时测量微粒间的微小相互作用力。可以说即是机械手,又是力的微探针。光钳作为“机械手”对生物微粒的生命活动的干扰极小,在整个操作体系涉及的细胞生存环境几乎等同与“天然”环境,细胞等的生命活动的变化得以完整保留并实时动态的展现给研究人员,是生物微粒静态和动态力学特性的理想研究手段。这对生物大分子行为的研究有很特别的意义。光钳作为力的探针,可以追踪在生物大分子进行各种生化过程的同时,生命过程的运动(位移和速度)、受力的大小和方向、彼此间的结合与分离等运动学和动力学特征,并使这些生命活动成为可控的,使得对它们的个体行为的研究真正从“观测”上升到“科学实验”,是研究活体生物微粒在生命活动中非常理想的一种手段。
单分子的研究近年来的迅速发展标志着生命科学研究等领域一个新的阶段的到来。该技术目前已在从分子生物学到细胞生物学等学科的一些重要的领域有所应用,将生物大分子的个体动力学行为真实地展现在科学工作者面前。但我相信这还只是一个好的开头,随着相关学科的发展,以及单分子科学研究的深入,单分子检测技术必将有更加诱人的前景。
事实上,自从shuming Nie那篇science以来,最近出现了单分子拉曼光谱(SM-SERS)的研究热潮,Xu组,Kneipp组,Otto组,包括一些工作组应用的TERS等,都有望在这方面有更大的突破和应用。。。

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