细胞体内发光的“测力器”

上一篇 / 下一篇  2010-08-16 10:36:35

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  说明:本文为由南京大学大学生自发组建的『大学生科学杂志』约稿而写的论文介绍,由于该杂志面向国内广大本科生读者,杂志宗旨是为培养大学生的科研兴趣以及训练科学思维,因而本文侧重阐述论文作者的科研思路,更注重作者如何为具体的研究设计实验,而非实验结果本身。本文尚为初稿,未经杂志编辑部修正,故目前谢绝转载。待文章修订之后,将刊出杂志社制作的PDF文档以供科学爱好者下载阅读。另外,我个人作为该杂志的义工,期望社会支持培养爱科学,爱思考的中国大学生,为吸引优秀学生进入科研领域的各界友好人士伸出援助之手,给予『大学生科学杂志』以资金支持,摆脱其目前局限于南京大学校内BBS上宣传的状态,使其致力于国内本科大学生的科研思想的启发的宏伟志愿能更好地实现!

  在各种复杂的生命现象当中,诸如发育,生理和病理等过程,生物体所受到的以及本身产生的机械力也是参与到这些过程当中值得引起人们重视,有助于加深人们对于这些过程的了解的一个重要层面。了解亚细胞结构层面的力的传导对于揭示这些复杂过程的微观机理也因此具有重要的意义。要研究此类问题,人们首先需要合适的工具能够探入到细胞体内对亚细胞单元之间的相互作用力进行测量。更为人们所熟知的,发展得也更为成熟的细胞体外的力学测量工具在此类问题上就变得束手无策了,比如原子力显微镜(局限于一个表面,因而不适用于细胞体内力的测量),光镊或者磁镊,由于需要借助折射率高于液体环境的透明塑料/玻璃微米量级的小球,或者磁性的微米小球才操控与小球特异粘连的生物分子,我们是难以想象把这些小球置于体积近似大小的细胞体内而不干扰细胞的生理功能而进行精微的测量。怎样的“测力器”可以胜任近乎不影响细胞的生理功能下对胞内的力学测量呢?而且我们知道之前提到的那些研究工具告诉我们很多生物分子之间的相互作用在皮牛(pN, 10-12 N)的范围,这样看来我们还要有很高的精度要求!我们知道物体之间的相互作用力往往是距离的函数,所以对于力测量的精度要求,可以表现在对于测定距离的精度要求上。而对于生命体,最为人们所熟知的干扰较小的研究工具,恐怕就是光了。我们恰巧有这样一个集合了这两者的工具可以被利用起来-----荧光共振能量转移(Fluorescence/Förster Resonance Energy Transfer, FRET)。如果两个荧光物质,A的吸收谱和B的发射谱发生一定程度的重叠,当两者距离靠近达到一定范围时(一般为几个纳米),被光子激发荧光的B就会把能量传递给不直接被激发的A,表现为A发荧光。这个能量转移的效率对A和B之间的距离非常敏感。这也便是维吉尼亚大学的Carsten Grashoff和合作者共同开发的用于探测在细胞迁移动态调控中纽蛋白(Vinculin)所受的张力而设计的力学探针的基石了。值得一提的是,对于针对性地测量细胞迁移运动当中,将细胞置于直立的弹性胶体的微柱之上培养,通过测定细胞迁移牵动胶体微柱发生偏移的距离来计算力的大小的方法缺乏必要的精度,因为其精度受限于胶体的杨氏模量的大小。

  纽蛋白是细胞粘着点(focal adhesion, 通俗地说是细胞贴附于一个表平面形成的较为集中的部位)所含的一种胞内蛋白,包含一个头部(head domain, Vh)和一个尾部(tail domain, Vt)并由一个弹性部分链接起来。头部Vh和talin蛋白分子结合使得纽蛋白聚集到细胞粘着点,而尾部Vt与聚合肌动蛋白(F-actin)以及 paxillin蛋白结合。人们发现细胞粘着点表现出较为复杂的力敏感性——当附着力增大时会促使粘着点的形成和增大,而力减小时,粘着点缩小或者消解(disassembly)。同时人们也发现机械力可以诱发粘着点的消解,包括滑落等形式。为了深入了解这些过程,作者设计了这样一个张力探针(tension sensor module, TSMod)——他们将取自蜘蛛丝的蛋白flagelliform中的一个长达40个氨基酸的弹性区域,插入两个可以有效发生FRET的荧光蛋白(mTFP1和venus)之间。作者再把这个探针插入到纽蛋白的头部Vh和尾部Vt的中间。我们可以想象如果有张力拉扯纽蛋白分子的两端,导致 TSMod的间距增大,致使FRET转移效率减小,那么我们就可以通过检测FRET转移效率的大小来定量纽蛋白受到的张力的大小。作为对照,不含尾部Vt 部分,而只在头部Vh一端链接TsMod探针的,由于不再和F-actin或者paxillin蛋白结合,就像只固定了一端(前文提到Vh和talin蛋白结合)的弹簧,并不会再受到另一端的牵扯而发生形变,故而FRET效率并不发生改变。他们的实验数据也很好的证实了这两个假设——调节纽蛋白受力是通过调节细胞粘着点的大小来完成的,例如细胞覆盖在纤维连接蛋白(fibronectin)上细胞呈拉伸状而在聚-L-赖氨酸(poly-l-lysine)层细胞为圆形。当然,任何影响FRET效率的因素都会对实验产生影响熟悉,比如链接有荧光对的不同纽蛋白分子间而非分子内的FRET的产生,又如蛋白本身的构象变化也会导致荧光对间距的变化从改变FRET效率,我们怎么确定所测的FRET效率主要是由于纽蛋白受力而导致的呢? 为排除不同纽蛋白之间的FRET的影响,作者将纽蛋白-mTFP1以及纽蛋白-venus的复合片段同时导入细胞中,实验发现两者之间的FRET效率非常的小,基本可以忽略不计。为排除纽蛋白构象变化的影响,他们也使用了一个专门测定纽蛋白构象的检测探针,通过同时施加actin和IpaA方可导致纽蛋白由构象而改变构象探针FRET效率的鉴定实验证实构象变化对于张力的测定并无显干扰。为了定量纽蛋白所受张力的大小,人们需要确定力的大小与FRET对间距的对应关系。为此,作者使用光镊和共聚焦显微镜的复合工具对链接有Cy3和Cy5 FRET荧光对(较之细胞实验所用的荧光蛋白光稳定性更好)的纽蛋白进行了测定。

  在生物学面,为检验纽蛋白对于富集粘着点的力的大小的依赖性,作者对细胞施以ROCK(Rho-associated kinase)的抑制因子及RNA干扰来减少依赖于肌球蛋白(myosin)的细胞收缩。结果显示纽蛋白的激活以及向粘着点的富集(recruitment)与经纽蛋白受力并不相关。此外,在细胞伸展端的面积较小的粘着点比细胞收缩端面积较大的粘着点所含纽蛋白所受的张力更大。并且他们还进一步证实粘着点与纽蛋白不堪张力重负有关。同时他们通过敲除纽蛋白也发现该蛋白对于维持受力之下的粘着点的稳定性具有重要作用。分析化学  仪器分析  红外光谱

  References and links

  ORIGINAL RESERCH PAPER Grashoff, C. et al. nature 466, 263-266 (2010).

  FURTHER READING Bershadsky, A. D. et al. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 19, 677-695 (2003).


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