生物转化的贡献及其发展前景
——追忆红酵母苯丙氨酸解氨酶(PAL)生物转化研发职业道路的20年
杨顺楷 四川 成都
导言
我们不能无视生物转化知识趋于成熟的客观现实，且已经导致在快速进展技术基础上建立的生物工业生产线，生产出了高质和/或高值的精细与专用化学品，医药中间体，化学多聚物和多样的化学实体。生物催化和生物转化已经广泛地应用在令人不可思议的形成新生物工业工艺过程及产品的生产。
本文通过笔者追忆经由红酵母(苯丙氨酸解氨酶，PAL)生物转化研发职业道路20周年之际，简要介绍生物技术和生物催化过程对化学化工领域的主要贡献，有关酶促转化主要的进化步骤，即它是怎样应用，以及由此造成对学术领域和工业界有怎样的影响。同时，也须得提醒业内人士要走出狭小的学术研究圈子，深入到可应用于化学和医药工业的生物技术中去，尝试经过分子进化和工艺参数优化研究，达到如所预期的理想状况，即整合化学转化，酶法转化，发酵和发酵过程，真正实现“技术可行经济合理”可持续性的绿色生物制造。
过小试技术鉴定关后的产业化之路
1991年3月13日是一个令笔者终生难忘的日子——通过了一个技术鉴定，它由中科院成都分院主持(副院长陈维新已谢世)在成都生物所召开(刘兆光所长已谢世)，邀请了中科院内北京上海及本地大学院所多学科的专家，包括酶工程，工业微生物(氨基酸发酵)，有机合成化学，药物化学及化工分离科学等，花了整整一天时间开会，对笔者团队的国内创新项目“红酵母生物转化肉桂酸制L-苯丙氨酸”进行了认真负责的技术鉴定。
这一由国家自然科学基金资助项目(1988-1990)批准意见中批示：“采用化学-酶法进行不对称合成研究，国内开展尚少，且目标为国内急需的L-苯丙氨酸(L-Phe)，显然有重要的应用前景。”这样，笔者就开始了肉桂酸/苯丙氨酸解氨酶(
PAL)生物转化技术途径生产L-Phe的研究工作。同期的国家“七五”攻关项目中，有关L-Phe部分也包括了酶法生产L-Phe的研究，即苯丙酮酸/
转氨酶途径和糖质原料直接发酵法生产L-Phe的研究项目。客观上，在当时国内就形成了3条技术途径竞相研发的态势。其后，国家“八五”攻关涉及L-
Phe项目，在当时有9家申报单位在不经开会论证的情况下，就拍板定案由南京的2家和上海1家院校搜入(主观)囊中。在经费断档的情况下，笔者秉着“东方不亮西方亮”的无奈心情，经由所企“横向合作”途径，终于在95年在江苏连云港通过了由江苏省科委和中国科学院成都分院联合主持的“微生物酶法转化肉桂酸直接合成L-Phe中间试验”技术鉴定会。在此基础上，浙江绍兴亚美生物化工公司作为民营投资方，认定了国家“七五”、“八五”、“九五”L-Phe项目国家攻关者未果情况下，选定了笔者团队的“肉桂酸-酶法生产L-Phe”项目作为技术依托，通过所企的中试技术转让，投资1000万元，于1998年建成了国内第一条L-Phe100t/a的肉桂酸/PAL酶法工业试生产线，并于98年秋顺利投产，结束了我国长期不能工业规模生产L-Phe的历史。
该生产新工艺属国内首创，是所企科技合作的结晶，基本上解决了国内久攻不下的难题。经过近年来的发展，已经形成了高技术产业化的模式。目前，该公司是国内唯一一家既能生产出L-Phe，又联产阿斯巴甜(APM)的“国家级高新技术企业”，到2005年产能已达500t/aAPM。此外，经由本技术途径生产
L-Phe的还有山西晋城和江苏滨海两家企业，每家产能约在300-500t/a。总之，自从上世纪末以来，我所开发的L-苯丙氨酸酶法生产新工艺(年产百吨级工业化试制)，已经先后在浙江绍兴亚美生化公司、江苏滨海常滨化工公司和山西晋城凤凰矿业集团煤电化工公司化工厂投入工业规模试生产，三家总产量累积已达到2000多吨，有效地缓解了国内L-Phe/APM的市场供求关系紧张的局面;L-Phe产品价格从1994～1995年的20万元/吨，下降到
2005年的8～9万元/吨的水平。伴随着国内外生物催化和分子进化技术的快速进展，借助基因工程菌E.coli糖质原料直接发酵法生产L-Phe的突破性进展，目前L-Phe产品价格已经在5万元/t(工业级)，这使得我国已经迅速崛起成为L-Phe/APM生产大国之一。
学术传承的尴尬
这一“非粮技术途径”生产L-
Phe的工业生物技术理应继续重视化学-酶法高水平研制非天然生理活性芳香氨基酸的生产及推广应用，国内外的市场缺口一直很大。但是，令人遗憾的是这一学术团队的传承在目前的刚性体制下难于运作，市场经济选择结果该路线终于在2005年停产。事实上，这一“肉桂酸-酶法生产L-Phe”项目的技术水平，完全可以替代进口的药用级(大输液)L-
Phe产品，因其杂酸含量低，产品质量高，废液排放量少;加之，我国石油化工和煤化工能提供充足的初级原料生产肉桂酸及其类似物，故该项目的发展潜力很大。据报道美国一家公司现在仍然在应用这一化学-PAL酶法生产L-
Phe;杜邦公司近年已报道在应用重组菌经葡萄糖发酵生产L-Tyr，再借助-PAL酶法转化生产对-羟基-苯丙烯酸，继之结合对其的化学法脱羧生产对-
羟基-苯乙烯(4-VP)单体材料，可见其合成生物学的多能性可进一步拓展化学化工新领域，它整合了发酵-生物催化和化学合成，体现生物制造的可持续性。
令笔者难解的是这种类型的资格科技项目一直被边缘化?进入不了“体制内”“长期被忽视”?!
要重视苯丙氨酸解氨酶(PAL)的多能性开发研究
PAL
属于裂合酶类，主要存在于微生物和植物，它是苯丙素代谢的中心酶(L-Tyr解氨酶，TAL亦然)。在所有次生代谢研究中，或许PAL是最广泛研究的酶，在某些植物，PAL是单基因编码，而在另外一些则是多基因家族的产物。PAL活性不需要辅因子，其反应引发出的氨离子经由谷氨酰胺合酶和谷氨酸合酶催化而得以循环。水生植物并不存在木质素，它是经由PAL的非氧化脱氨生成的肉桂酸而进入陆生植物的木质素代谢的。所以，PAL(TAL)的酶促步骤和其代谢途径生成的多样性的苯丙素及其苯丙素乙酸酯产物一直是植物生物化学及分子细胞生物学关注的热点。过去20年国内外从应用酶学角度，关注PAL(TAL)的工业生物技术开发重要事件有：
1998-2005，国内3家民企投入开发《红酵母PAL生物转化肉桂酸100t/a级L- Phe工业试生产》运作，共计产出L-
Phe 产品(工业级)2000多吨，结束了长期依赖进口的局面。
1999年春，PNAS报道称加拿大已经研制出一个经由插入酶基因到细菌中，大量产生PAL的方法，包括该菌的大规模培养、分离细胞物，以及大规模地分离纯化制PAL的工艺过程，但PAL的制造成本没有提及。
2000-2005年，笔者实验室也利用选育的本土粘红酵母菌株CIBAS A1401(已应用国内于工业试产L-
Phe)开展了PAL的分离纯化与性质研究;部分分子生物学实验研究工作。
同期，国外PAL药用酶开发治疗幼儿遗传性疾病——苯丙酮尿症(PKU)：
PAL/PKU小鼠模型试验中，口服纯酶制剂，在1～2小时期间，血液Phe水平降低到50～54%。按临床要求，该PAL酶要降低Phe水平到
70～80%，才有临床治疗PKU的价值。PAL/PKU的研制历程已经有了相当可观的进展，国内也有少量分散类似研究，进展不大。
2005年，在《分子治疗》(英刊)杂志上，一篇简报报道了重组红冬孢酵母的PAL，经由PEG化学修饰，获得的PAL衍生制剂，经体外和动物的体内试验表明大部分制剂均呈现好结果，特别是20KDa的PEG-PAL组合保持了对Phe的催化活性，消除了体内的免疫原性问题，提示这是一种新型的PKU生物治疗剂诞生了。
同年，德国慕尼黑一个从事植物转PAL基因研究成果，同美国肯塔基大学烟草研发中心合作开发进行田间种植试验。作物是含有的PAL基因经由遗传工程方法转移到烟草叶绿体中进行超量表达。种植试验收获含PAL作物有两个用途：其一，分离纯化PAL用于治疗遗传疾病PKU;其二，作为工业生物催化剂用于工业生物合成L-Phe及其结构类似物。此外，该种植试验还可以因为PAL的强力表达，积累经由苯丙素代谢途径所产生的具有商业价值的生理活性代谢物。
2009年6月9日，美国加州一家纳斯达克上市公司宣布：依据PEG化的PAL药酶制剂上I相临床试验治疗PKU研究结果，继续实施II相临床试验研究计划。FDA已经过对该临床试验方案的评估，观察到了PEG-PAL血浆浓度与血液Phe水平的相关性;它能显著降低血液中Phe水平，且无副反应。I相临床试验治疗PKU的关键发现：降低血液中Phe水平降低幅度在36%-97%(均值62%)。可以预期II相临床试验在经过优化剂量，给药途径，考察耐受度及安全性，药动学的基础上，将会有一个PEG-PAL治疗PKU的生物治疗结论。诚如是，这将给世界上数以10万计(仅欧美现有5万，我国至少不会低于此数)的PKU患儿带来福音。
总之，如上笔者追忆红酵母苯丙氨酸解氨酶(PAL)生物转化研发职业道路的20年，可以看出国内外生物催化和生物转化已经广泛地应用在新生物工业工艺过程及产品的生产，其作出的贡献及其发展前景是无比广阔的。但是国内落后的科技管理体制，错位的用人标准，的确是严重制约了这一进程，PAL这一应用酶学及酶工程研究国内的20年是太令人失落加失望的。
