抗肿瘤方面细胞实验 心得

上一篇 / 下一篇  2011-05-23 14:57:01 / 个人分类:细胞生物学

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养细胞1年多了,走了很多弯路,我从我曾经的疑惑或者犯的错误出发讲起,能够让部分人少走点弯路,那我就知足了。


我之后的实验方向与细胞实验基本无关了,所以此时写点心得也是对自己的总结。


因为多是个人总结的经验,难免有错误,请多见谅;


个人的经验也离不开曾经别人的指引,需要感谢帮助过我的同学及坛友。
我最初养细胞时,实验室并没有储备课题所涉及的细胞,所以最初筹集细胞占用了较多时间,我首先想讲一下细胞的运送;

1、寄运细胞或者接收细胞,都要做好充足的准备;


        如果是让其它实验室寄运细胞,或者寄给别人细胞,细胞应该如何处理是主要考虑的问题。假设细胞在途中要经过48小时,那么可以待细胞长到50%的密度时处理细胞,即将细胞培养瓶内加满培养液,拧紧瓶盖,用封口膜封紧瓶口;然后将培养瓶放进泡沫盒,用纸或泡沫将盒内空间填满,使培养瓶不能随意移动。同时将泡沫盒钻上几个孔,使空气可以流通。


        因此要确定准备好以下物品:透气的细胞培养瓶;封口膜;足量的培养液;放细胞培养瓶的泡沫盒及填充物;


        除了细胞的处理,还要注意以下几点:1)提前跟快递公司人员联系,要上门取货(大多快递公司都可以,顺丰确实算是好些;近来觉得韵达速度也很快)2)时间安排(细胞处理尽量安排在下午,因为快递公司一般来说都是晚上统一发货,要是早晨处理细胞交给快递公司,细胞还没上路呢,就已经在培养箱外待了一天);


        接收细胞就容易多了,提前准备好细胞培养用耗材及培养用液就可以了,紫外灯先打开,收到细胞将培养瓶中大部分培养液吸掉,留下4-5ML培养液(针对25cm2的培养瓶);培养一天后,观察细胞状态,确实是传代还是换液。


        总而言之,运送细胞讲究两点:1离开了培养箱要防止被污染2尽量缩短细胞不在培养箱的时间,不然时间过久细胞长满脱落就没得救了。



2 要讲的是MTT试验,这个纯粹讲个人经验,因为我本身的考虑可能就是错的,所以非常欢迎提出疑问以及批评指正。


        1)细胞的铺板:以96孔板为例,做细胞实验的同学看文献可能注意到,有较多的文献中提到细胞接种数量是5000个/孔;最初我也是按照这个数量来铺板的,实际上这个接种数量偏高;假设给药时间是48小时,发现空白对照孔中会有细胞无法贴壁,因为太满了,被挤出来了。如此,则会因为接种密度原因,而不能准确反映细胞的正常生长情况及给药组作用情况。即使是给药时间为24小时,仍然会出现类似情况。


        因此,我后期实验中接种细胞数量为3000-4000,如果是药物作用48小时,最好是3000cells/每孔,空白对照孔细胞在加MTT前也就刚好长满,后来才发现别人也很多按照这个数量接种的,只是提醒需要注意,不要盲目的按照5000这个密度,还有的是10000,基本上不靠谱。


        很明显,接种细胞数量太少也不好,太少的话SD值会很大。


        还有的人根本就不计数,经验主义,一个25cm2培养瓶细胞长满铺一个板;经验当然是有用的,但在这里就明显不合理了,刚才提到MTT实验对细胞的数量要求相对较精确;另外,如果你是铺几个板,都这样做,本来每个培养瓶细胞数差异就不小,因为你传代时做不到等量,就这样直接铺到板上,不同板之间又有各组药物的对照实验,那么得出的OD值还可以比较吗?所以计数是必要的


        2)给药:对于水溶性药物就不讲了,只讲难溶于水,而且虽然溶于DMSO,但向DMSO加水后也会析出的药物;有人是这样做的,在EP管中用DMSO溶解药物作为母液,然后用细胞培养液将母液梯度稀释成各个浓度,药物有析出,成结晶了,可能都沉了,严重不均一了,这浓度就没法衡量了;


这样做的人,也想过不合理之处,但又没有查到好的办法,所以将就着做了,其实差多了,有效的药物也做成无效的了。


还有一个错误容易犯,DMSO母液用培养液稀释10倍后是不可以作用于细胞的,因为这样DMSO占的比例是10%,本身毒性就很大;我曾经单独测过DMSO对细胞的毒性,1%确实基本无影响,但5%以上则是影响特别大。现在做个假设,用DMSO稀释母液,而非用培养液,在EP管中用DMSO梯度稀释药物成各个梯度浓度,然后直接加到含培养液的96孔中,假设96孔中培养液为197微升,那么加药的体积只能是3微升或者小于3微升。我觉得可以这么做,操作会更麻烦,难度上稍大了点,但不是不能做。对于没有一点亲水基团的药物,我就是这样做的。


有些药物常温下难溶于水,可能加热溶解性会很好,由于专业涉及面不同,很多人会忽略这方面。开始做阿霉素时就没注意到,后来听企业人员说加热到55℃可以很好的溶解,按此法溶解效果很好。


另外我认为,对溶剂进行优化是进行难溶性药物实验要学习的一个方面,找到加水后药物不析出的药物溶剂,可以是有机溶剂,也可以是制剂中用到的辅料;对于已经上市的用于注射剂的阳性对照药,肯定有办法,像顶顶大名的紫杉醇,其实就是用吐温80和乙醇。


3细胞的消化前几天到学院路玩,两个人说到养细胞,一个说是细胞养的越久越容易消化,另一个说是细胞养的越久越难消化;谁说的对,我不确定;但多数人消化没有一惯的按照同样的方法进行消化细胞,主要说两个因素:胰酶的活性(胰酶的品牌及已经使用的时间,反复冻融的次数等),消化的温度(包括加入胰酶液的温度和培养器皿外环境的温度)。


为了保持一惯性,建议如下:1是胰酶分装2胰酶的温度和环境温度一惯性


不要小瞧了这般,可能遇到难消化的细胞时,就表现不出自己是个养细胞的人了:都不知道把胰酶融化后多放在37℃几分钟,也不知道将将细胞转移到培养箱消化,也不考虑自己的胰酶已经反复冻融了多次。当然也可能有些人养了一年或两年细胞,从没碰到难消化的细胞。
如果这样也不行,利多卡因(5ml装利多卡因+7.3mlPBS)方法也是可以用的,当时养RAW264.7中途碰到消化不掉的情况,利多卡因这个方法是院里老师传授的。其实网上搜也能搜到,但比较麻烦,因为网上可能众说纷纭,你不可能试了一个又一个。明显经验是很重要的,如果没人带着做实验,自己很容易乱放炮,不得要领,这都有体会。


4悬浮细胞的培养根据常规培养悬浮细胞的教程来看,培养过程要比贴壁细胞容易;我最初拿到K562细胞时,我问及注意事项,其中一个是如何判断细胞长满?对方说培养液变黄时就可以换液或者传代了。我觉得不怎么合理,但又没有想到好的办法。开始几天就这样养的,同时查找资料寻找更合适的方法。当时没事喜欢发贴子。通过小木虫的求助,得到了较满意的答复,并且按照这个建议一直做下去,发现是挺可行的。
接种密度控制在1-3×10^5cells/ml就可以,有时0.2-0.5×105cells/ml的低密度接种也是可以的,不必把密度接种很高,这样影响细胞的生长,也增加培养基的消耗和人工。当细胞的密度增加到6-10×10^5cells/ml时(通常用72hrs)就对细胞进行传代。维持低细胞密度是非常好的办法。经常计数,是掌握细胞生长规律最好的办法。
先写这些,希望大家能够多多批评指正,共同进步。


TAG: 抗肿瘤 细胞实验

 

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