经验:一步法Tunel 细胞凋亡检测

上一篇 / 下一篇  2010-07-09 14:12:00 / 个人分类:心得体会

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  使用说明:

  1. 对于贴壁细胞或细胞涂片:

  a. PBS或HBSS洗涤一次。

  b. 如果细胞贴得不牢,可以干燥样品使细胞贴得更牢。

  c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。

  d. 用PBS或HBSS洗涤一次。

  e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106),冰浴孵育2分钟。

  f. 转步骤5。

  2. 对于悬浮细胞或细胞悬液:

  a. 收集细胞(不超过200万细胞),PBS或HBSS洗涤一次。

  b. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团,宜在侧摆摇床或水

  平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。

  c. 用PBS或HBSS洗涤一次。

  d. 用含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)重悬细胞,冰浴孵育2分钟。

  e. 转步骤5。

  3. 对于石蜡切片:

  a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯,再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟,蒸

  馏水2分钟。

  b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K,在20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。

  c. PBS或HBSS洗涤3次。注意:这一步必须把蛋白酶K洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。

  d. 转步骤5。

  4. 对于冷冻切片:

  a. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。

  b. PBS或HBSS洗涤2次,每次10分钟。

  c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106),冰浴孵育2分钟。

  d. 转步骤5。

  5. 配制TUNEL检测液:

  参考下表配制适当量的TUNEL检测液,需充分混匀。注意:配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕,不能冻存。

  1个样品5个样品10个样品

  TdT酶 2μl 10μl 20μl

  荧光标记液48μl 240μl 480μl

  TUNE检测液50μl 250μl 500μl

  6. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片:

  a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

  b. 在样品上加50μl TUNEL检测液,37℃避光孵育60分钟。注意:孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿

  润,以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。

  c. PBS或HBSS洗涤3次。

  d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm,发射波长范围为515-

  565nm(绿色荧光)。

  7. 对于悬浮细胞或细胞悬液:

  a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

  b. 加入50微升TUNEL检测液,37℃避光孵育60分钟。

  c. PBS或HBSS洗涤2次。

  d. 用250-500微升PBS或HBSS悬浮。

  e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm,发射波长的

  范围为515-565nm(绿色荧光)。

 

 

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