猪链球菌2 型检验程序

上一篇 / 下一篇  2010-07-13 10:52:38 / 个人分类:细菌学

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  一、 分离步骤和程序

  1.可采集病人的血,腹水,脑脊液或者是尸检标本;病、死猪的肝脏、脾脏、腹水、心血。4℃保存。

  2.制作肝脏、脾脏的触片,或用腹水、血液、脑脊液涂片,火焰固定后进行革兰氏染色,油镜下观是否有成对或短链状革兰氏阳性球菌。

  3.取有成对或短链状革兰氏阳性球菌的标本接种选择增菌培养液(含15 微克/毫升多粘菌素B,30 微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基),或直接划线接种含两种抗生素的羊血琼脂平板培养基,在蜡烛缸或CO2 培养箱中培养。

  二、 血清学检测

  1.用兰氏分型乳胶凝集链球菌试剂盒进行分群

  2.用猪链球菌1-34 个型血清进行分型取一滴猪链球菌诊断血清悬滴于载玻片上,与一滴菌悬液充分混合,或用接种环(牙签也可)刮取单个菌落直接与血清混合,观察是否出现凝集反应,同时用生理盐水做对照。

  三、 生化反应

  可用API 生化鉴定系统的api-strep 手工鉴定条进行鉴定,该方法可直接鉴定到种。普通实验室可以重点做VP , 七叶苷水解试验,6.5%的氯化钠生长试验,45 度﹑10 度生长试验,胆汁耐受(麦康凯培养基)。结果依次为阴性,阳性,阴性,阴性,阴性,阴性,可初步认为猪链球菌。可送交到有条件的单位做进一步鉴定。 具有参考价值的生化反应项目有:

  生长特性

  10℃ 45℃ 6.5%NaCl PH9.6 麦康凯培养基(胆汁耐受)

  不生长 不生长 不生长 不生长 不生长

  发酵试验

  棉子糖 RAF 乳糖LAC 甘露糖MNS 山梨醇SOR 阿拉伯糖ARA 核糖RBS

  + + — — — —

  葡糖INU 甘露醇MAN 丙酮酸 PRV 甘油Glycerol 松三糖melezitose 马尿酸盐hippurate

  + — — — — —

  四、 基因鉴定,包括使用PCR 技术和对PCR 产物进行序列分析

  可挑取分纯的菌落或在选择平板上湿润的可疑菌落,直接进行PCR 检测。

  1、 检测猪链球菌种特异性16S rRNA。

  上游引物:cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物:gtaagataccgtcaagtgagaa

  2、 检测猪链球菌荚膜多糖基因(cps2A)

  上游引物:gttgagtccttatacacctgtt 下游引物:cagaaaattcatattgtccacc

  3、 检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段(mrp)

  上游引物: ggtatacctt gctggtaccg ttc

  下游引物:agtctctaca gctgtagctg g

  4、PCR反应的条件:

  94℃预变性5 分钟;94℃、30 秒,60℃、30 秒,72℃、30 秒,25 个循环,最

  后延伸72℃、5分钟。取5 微升扩增产物在1.2℅的琼脂糖凝胶中进行电泳。

 

 

分析化学  仪器分析  红外光谱


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