奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

上一篇 / 下一篇 2013-01-28 00:23:19

北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。分析测试百科网"Iq(n&}8F[-K
本文采用天津博纳艾杰尔科技的Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（货号：MS-DI5001）和Venusil^® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。

实验部分
^5m4{K"g0a#J[0仪器和试剂
1Z})Hk5K8{$c5H0高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。分析测试百科网 mIu:s Y
双氰胺标准品，Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。分析测试百科网Lt!~Jh#f U
实验方法分析测试百科网VNcmQ%z%`oY
提取、净化分析测试百科网z3B!j/t$k
称取1g试样于50ml具塞离心管中，加入2ml水溶解后，加乙腈定容至10ml，超声10min，8000r/min离心5min，取2ml上清液加Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管中，，涡旋0.5min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22um滤膜，待测。
[T nVh u-_0
HPLC法：
o+}F N*y_ nok0
色谱条件：
4WBw&gX6^oR2}0色谱柱：Venusil^® HILIC 5μm 100Å 4.6*250mm；
流动相：A：10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）；分析测试百科网D~Or(nt;u&V
B：乙腈；
\IIb*^F0A：B=10:90；分析测试百科网#C;U%EXr#n6df5p
检测波长：220nm；
l-bd s,N,o0进样量：10µl；
I:s,_1E{;Lz0柱温：30℃；分析测试百科网0Hq%C%Mk!bM f2|
流速：1ml/min。分析测试百科网9Pe9}ndvH
分析测试百科网w)aAj$fk
实验结果：分析测试百科网3} g&}Y5T6^ _G
线性关系和检出限
8i fH#A,uiu8n0准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；分析测试百科网PVPqT#C;w
分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为0.1µg/ml，0.5µg/ml，1.0µg/ml，2.0µg/ml，5.0µg/ml和10.0µg/ml的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表2：

表2 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	4.92min	Y=116.44X+3.2699	0.9997	0.1µg/ml

分析测试百科网9r%[5q5v8` Uo_
检测方法稳定性考察分析测试百科网L9oN0E6hgHr
选用10.0µg/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表3：

表3 检测方法定性和定量稳定性考察考察（HPLC法）

标号	保留时间，min	峰面积
1	4.930	1061.7
2	4.933	1072.2
3	4.930	1064.4
4	4.929	1079.7
5	4.930	1067.3
6	4.934	1073.6
RSD，%	0.04	0.62

2kQ'r `lr}J0准确度和精密度
K'I!`+A(MT/l0选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表4

表4 10µg/g添加回收实验结果（HPLC法）

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
98.6	88.4	89.8	92.3	5.99

LC-MS/MS法：
*EXV3M/\1l K:c/i0
v:h:~,d+d0色谱条件：
)@.E"?[D ?{Z0色谱柱：Venusil^® HILIC 5μm 100Å 2.1*150mm；
/}d7HYV AA*PE0流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）
)z7iIW'a`x0B：乙腈分析测试百科网4bX8| e d5b
A：B=10:90分析测试百科网q(v{ s*x-p3X"p
进样量：10µl；
VH$~b-k4~f0柱温：30℃；
流速：0.2 ml/min。
l4Y/jo4Op0
:@ I|AR0质谱条件分析测试百科网#oS;rd1Y.mu:TR
质谱仪：API 4000+；分析测试百科网E FE9sbgk
离子源：电喷雾离子源；分析测试百科网k5p3eOY
扫描方式：正离子扫描；分析测试百科网^5}(DC;F
检测方式：多反应监测；
3Kx:d!N$N~s0CAD：8.00；
a{a"kl0CUR：10.00；
9Y'{ Wy'K0GS1：60.00；
'Li G(z?4p0GS2：50.00；
s\)hMw0IS：5500.00；
wa5{G5a4y)\1Qc:p0TEM：500.00。

表5 双氰胺质谱信息

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85/68	71	10	41	6
	85/43	71	10	41	6

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

实验结果分析测试百科网*cY8Jaf G
线性关系和检出限
doSS&hi ~0准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
8J/FA$l:YGVG^1K0分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和500ng/ml的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表6：

表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	3.15min	Y=8777.2X+7435.9	0.9993	5ng/ml

检测方法稳定性考察分析测试百科网 u+y:J/\!Ct4[m6{
选用50.0ng/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表7：

表7 检测方法定性和定量稳定性考察考察（LC-MS/MS法）

标号	保留时间，min	峰面积
1	3.29	382950
2	3.30	387950
3	3.25	382840
4	3.31	399820
5	3.30	378580
6	3.30	383810
RSD，%	0.65	1.92

Jl8u*T0w+k'i0准确度和精密度分析测试百科网0{no am$}L8PA
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表8。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表8 100ng/g添加回收实验结果

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
84.6	80.7	90.2	85.2	5.61

双氰胺检测方法包订货信息

产品名称	规格型号	货号
MAS-QuChERS-双氰胺净化管	100mg/10ml，100支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC	4.6*250mm，5μm，100Å	VH952505-0
Venusil HILIC	2.1*150mm，5μm，100Å	VH951502-0
微孔滤膜	0.22μm，直径13mm,200/PK	AM021320
双氰胺对照品	1g/瓶，含量≥99.0%	DCD-0001
离心管	50mL，带螺纹盖，25个/包	L050025-C
一次性无菌注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML

附图

;fCy%kh ~0Sh@9|0图1 定性定量稳定性考察谱图（HPLC法）
R+B$J Tj4h{0
VVWB6EVz(s#@L0图2 双氰胺0.5μg/ml标准溶液谱图（HPLC法）
;O;q BfW%a0
Z/l#~6EA8T@:y&Z0图3 奶粉空白谱图（HPLC法）分析测试百科网]h9dT^LG.H6T
分析测试百科网/Y.NO yh5e'J
图4 奶粉10μg/g空白谱图（HPLC法）
9Hhg9O)MGNS2U0分析测试百科网$c1UXIK
图 5 10ng/ml双氰胺标准溶液质谱图
;|j+T)aS+h0分析测试百科网3uA fU,a v;p)e
图 6 奶粉空白质谱图