婴幼儿奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

上一篇 / 下一篇 2013-01-30 00:48:10

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北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。分析测试百科网/fN2fDT\e EN
针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500mg/15mL，货号：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。
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@`rJ U {01 实验部分分析测试百科网c}h?K
分析测试百科网&?HGf+|-L6y \
1.1 仪器、试剂与材料
V \/rX/O%HS/P0高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。分析测试百科网J#o9CE*nr"]
双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

TOwH\l!u.Y+{01.2 实验步骤
b+~XUKW AT0称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。
D B'VZq9g0注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；分析测试百科网+sY"}0p#K$@7MF$y
2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。分析测试百科网@;s+U"GU[Lz

\qb%XMh3g9^01.3　实验条件分析测试百科网![2tf;M:]wv0S A
1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）：
WX6`%F'k(uVB7Me0色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；分析测试百科网d,YAv,Hyt!J2q
流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85；分析测试百科网gus+wI
波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：0.8mL/min。
tqP$B-ma-Y01.3.2 LC-MS/MS法：
8q}%H]h@'i3K0（1）色谱条件：分析测试百科网pp8]p,v jh't
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；分析测试百科网+Cm9~ T Qwz tk
流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）
eb-qq?/D?0B：乙腈；
oO ]%N ^X-|P|$T0进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。

表2 流动相梯度程序

时间，min	A%	B%
0	10	90
0.4	50	50
1.8	50	50
1.9	10	90
7	10	90

*备注：本文曾尝试过多种C18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于LC-MS/MS；也曾尝试过MERCK ZIC-HILIC柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的Venusil HILIC柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。
（2）质谱条件：
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。

表3双氰胺质谱信息

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85.1/68.1	71	10	41	6
	85.1/43.1	71	10	41	6

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

2.结果与讨论

2.1 高效液相色谱法：分析测试百科网 _A%bXl.T
2.1.1双氰胺的液相色谱图

2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限分析测试百科网-GQ3mDIE.nx%k
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；分析测试百科网8Hn?:M1L[9R0j
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：

表4 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	5.57min	Y=108.16X+27.827	0.9971	0.5µg/g

2.1.3准确度和精密度
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5

表5 0.5µg/g添加回收实验结果（HPLC法）

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.3%	85.5%	89.1%	85.63%	3.97%

2.2 LC-MS/MS法
2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图

2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：

表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	2.25min	Y=3859.1X+23694	0.9900	2ng/g

2.2.3准确度和精密度分析测试百科网(y;iT;Mlk%]
选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表7 10ng/g添加回收实验结果

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.5%	83.5%	89.3%	85.2%	4.31%

?Ba1v2S(l*{*J4} z&~0

3.产品订货信息

产品名称	规格型号	货号
新一代MAS-QuChERS-双氰胺净化管（填料量加大，更适合婴幼儿奶粉等复杂样品）	500mg/15mL，50支/包	MS-SQA02
MAS-QuChERS-双氰胺净化管	100mg/2mL，50支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC液相色谱柱	4.6*250mm，5μm，100Å	VH952505-0
Venusil HILIC液相色谱柱	2.1*150mm，5μm，100Å	VH951502-0
微孔滤膜	0.22μm，直径13mm, 200/Pk	AM021320
双氰胺对照品	500mg /瓶，含量≥99.0%	DCD-0001
双氰胺对照品	1g /瓶，含量≥99.0%	DCD-0002
离心管	50mL，带螺纹盖，25个/包	LXG0050
一次性注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML