超高效液相色谱在药物分析中的应用

    （本文作者：天津市药品检验所  郝桂明等）
    2004年3月,Waters公司率先推出了第一台商品化的超高效液相色谱系统(acquity, UPLCTM)。超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)系指一种采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2μm)和超高压系统(压力大于105kPa)的新型液相色谱技术,能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度,同时大大缩短分析周期,因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。问世4年来,超高效液相色谱质谱联用技术(UPLC-MSn)发展很快,现已成功应用于农药残留物检测、水质和环境监测、化妆品质量控制、药物及制剂的分析检测和质量控制、中药复杂组分分析及代谢组学等领域。现仅从UPLC的原理及优点出发,综述UPLC及其联用技术在药物分析领域中的应用,讨论目前UPLC存在的局限性,并对其进一步应用进行展望。

    1　UPLC的原理及优点

    1.1　UPLC的原理　

    UPLC的理论基础为范德米特(Van Deemeter)方程。HETP=AdP+B/v+CdP2v式中: HETP为理论塔板高度; A为涡流扩散系数; dP为填料粒径; B为分子径向扩散系数; C为传质因子; v为流动相线速度。由该方程可得出结论:颗粒度越小柱效越高;每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速;更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方向移动,而且有更宽的线速度范围。所以降低颗粒度不但提高柱效,同时也提高速度。但是,应当看到在使用小颗粒的固定相时,会使Δp大大增加,使用更高的流速会受到固定相的机械强度和色谱仪系统耐压性能的限制。然而,只要使用很小粒度的固定相,并且只有在达到最佳线速度时,其具有的高柱效和快速分离的特点,才能显现出来。因此要实现超高效液相色谱分析,除必须制备出装填粒度小于2μm固定相的色谱柱外,还必须提供高压溶剂输送单元、低死体积的色谱系统、快速的检测器、快速自动进样器和高速数据采集、控制系统等。上述几个单独领域最新成果的组合,才促成超高效液相色谱的实现。

    1.2　UPLC的优点　

    基于1.7μm小颗粒技术的UPLC与人们熟知的高效液相色谱(HPLC)技术,具有相同的分离原理。不同的是,UPLC不仅比HPLC具有更高的分离能力,而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。使用UPLC可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作,并获得优异的结果。

    1. 2. 1　提高分离度　

    UPLC发挥了1.7μm颗粒提供柱效增高的全部优越性。尤其是1.7μm颗粒提供的柱效比5μm颗粒提高了3倍。因为分离度与粒度的平方根成反比, 1.7μm颗粒的分离度比5μm颗粒提高了70%。在梯度分离中也具有同样的优越性,此时分离能力用峰容量衡量。

    1. 2. 2　提高分析速度　

    由于UPLC系统采用1.7μm颗粒,柱长则可以比使用5μm颗粒时缩短3倍而保持柱效不变,而且使分离在高3倍的流速下进行,结果使分离时间缩短而分离度保持不变。

    1. 2. 3　提高检测灵敏度　

    浓缩样品和采用各种高灵敏度的检测器都能提高灵敏度,而在UPLC中通过减小颗粒度,使色谱峰变得更窄,信噪比(S/N)增大,灵敏度得到额外的提高。

    1. 2. 4　提高质谱离子化效率减小基质效应　

    LC-MS已经是液相色谱发展的主流,能够充分发挥LC高分离度和MS高灵敏度的优势, UPLC与MS的联用使这种优势更加明显:一方面,UPLC系统达到最佳线速度时,其流动相流速一般在0.25～0.50ml/min之间,这与质谱能承受的流速更加匹配(API接口一般能承受0.20ml/min),使离子化效率增加,而新的nano UPLC的流量更可低至200nl/min,可以不需分流而直接进入质谱;另一方面,UPLC的分离度比HPLC有很大提高,其色谱峰扩展很小,峰浓度很高,这样不但有利于化合物的离子化,同时有助于与基质杂质分离,在一定程度上能降低基质效应,从而使灵敏度和重现性得到提高。

    2　UPLC在药物分析领域的应用

    2.1　化学药品的分析　

    Nguyen D T等应用UPLC分离分析异烟肼、吡嗪酰胺和利福平,采用1.7μm粒径的色谱柱进行梯度洗脱。在柱温为30 ℃时, 3种抗结核药物完全分离时间为2min,而USP方法(HPLC)的分析时间为15min。将柱温提高为90℃时,分析时间则缩短为1min内。

    在针对药物合成的分析方面,UPLC可实现随时快速准确检测合成过程中的中间体、副产物或降解产物等。Dongre等将UPLC用于磷酸伯氨喹及其异构体和合成中间产物的分离及分析。

    Jurgen Mensch等建立了UPLC-MS/MS在药物透析力分析中高通量筛选方法。使用四极杆质谱单体化合物多反应检测(MRM)在正离子模式下检出各种化合物。已确证的化合物包括咖啡因等,其线性范围均在3.05～2555nmol/L。此方法在缓冲液中检测限为0.61～12nmol/L之间。利用UPLC-MS/MS样品处理量提高了4倍,灵敏度显著增加。该方法能成功运用于早期药物筛选。

    2.2　生化药品的分析　

    Boogers I等分别利用HPLC和UPLC分析经柱前衍生化处理后的蛋白质水解物中氨基酸。结果表明, 两种方法的结果基本一致, 但UPLC的分析时间仅为HPLC的40%。Muhammad Saeed等利用UPLC-MS/MS分析经1, 2-萘醌或酶活化1, 2-二羟基萘与DNA反应后生成腺嘌呤N3位与鸟嘌呤N7位的脱嘌呤内收体,探讨了萘诱发肿瘤的机制。经UPLC-MS/MS检测, 发现邻醌通过与DNA发生1, 4-米氏加合反应是萘与一些芳香族化合物弱致癌作用的普遍机理。

    2.3　中药成分的分析　

    中药含有大量的生物碱,通常为中药的活性成分,研究这类成分具有重要意义。在采用HPLC法分析生物碱时,由于固定相表面残余硅羟基的影响,此类化合物色谱峰的保留行为会发生变化,造成色谱峰严重展宽和拖尾,因而在分析时常需要在流动相中加入添加剂,如离子对试剂、有机胺类等,用以屏蔽固定相表面残余硅羟基的作用,但这些添加剂的加入往往会给LC-MS联用带来不便。Waters公司合成了1.7μm颗粒度的Acquity UPLC填料,减少了固定相表面残余硅羟基,因而在分析生物碱类样品时,流动相中只加入酸抑制剂,不需添加有机胺即可使其获得良好的分离。由于在流动相中避免了有机胺及盐的加入,可以在一定程度上降低质谱噪音、减少对质谱的污染,且使用的流速适合与质谱直接联用,无需分流,可以进一步提高检测灵敏度,为中药分析提供良好的平台。

    DanM等利用UPLC-MS研究了中药人参中的主要人参皂苷成分,用Waters Oasis(TM)HLB固相萃取柱对样品进行提取,采用Waters Acquity BEH C18色谱柱,以0.05%甲酸溶液-乙腈为流动相对15种人参皂苷进行梯度洗脱,并对其进行定量分析。Chen X J等利用UPLC-MS检测研究淫羊藿中的黄酮类物质,采用Acquity BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm,1.7μm),以50mmol/L冰醋酸溶液-乙腈进行梯度洗脱,在12min内对淫羊藿中的15种黄酮类物质进行分离,并以淫羊藿A、B、C和淫羊藿苷为指标,对37个样品进行了分类。Chen J等采用UPLC和HPLC方法对丹参药材中丹酚酸B含量测定结果进行了对比,两种方法的含量测定结果一致。UPLC能够替代HPLC测定丹参药材中丹酚酸B含量,既加快了分析速度,达到了样品分析的高通量,减少有机溶剂的使用,又得到更高的分析灵敏度。Tang J等利用UPLC快速测定血栓通注射液中5种皂苷成分的含量,在9.5min内使三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd达到良好分离, 在测定的浓度范围内线性良好(r=0.9984),日间及日内精密度的RSD均小于3.1%,最低定量限和最低检出限可分别达到0.5ng和0.2ng,平均回收率均大于95.0%。Zhou等利用UPLC建立前列安通片中芍药苷含量的检测方法,采用Acquity BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm,1.7μm),以乙腈-水-醋酸为流动相,以0.2ml/min进行洗脱,芍药苷的保留时间为2.24min。该方法快速、简单,分离度和灵敏度高,可用于对前列安通片中芍药苷的含量测定。Yang XL等采用UPLC同时测定解郁丸中芍药苷和阿魏酸的含量。芍药苷、阿魏酸和其他组分在4min内可完全分离,芍药苷在18～180mg/L范围内呈良好的线性关系(r=0.9999);阿魏酸在2.18～21.8mg/L范围内呈良好的线性关系(r=0.9998);方法的回收率、精密度、重现性均符合要求。

    2.4　药物代谢动力学研究　

    药物代谢动力学涉及药物在肌体内吸收、分布、代谢和排泄过程的研究,包括药物及其在各种复杂基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中代谢物的分离、结构鉴定以及痕量分析测定。肌体的体液系统中存在大量的保留时间相同、相对分子质量也相同的干扰组分;而目前药物研制日趋低剂量,使常规的分离检测技术难以满足复杂介质中痕量成分准确定量的要求。能否在复杂的体液系统中快速检测和鉴定出药物的代谢产物,依赖于高效的色谱分离和灵敏的高分辨质谱技术的联用。采用UPLC-MS联用技术进行药物代谢及药物动力学研究,体现了其高灵敏度和高专属性特点,而且能够同时测定样品中复方制剂的多组分浓度,实现样品高通量分析。

    2. 4. 1　化学药品代谢产物的分析　

    Dasandi B等建立了UPLC-MS/MS定量测定人血浆中喹那普利和喹那普利特的方法,采用Acquity BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm),以赖诺普利为内标,喹那普利和喹那普利特线性范围分别为5.010～500.374ng/ml和10.012～1000ng/ml,定量限分别为5.010ng/ml和10.012ng/ml。日内和日间精密度的RSD均小于10%,喹那普利、喹那普利特和赖诺普利的回收率分别为85.8%、62.6%和61.3%,样品的分析时间仅需3min。Zhang SQ等利用UPLC-MS/MS对人血浆中紫杉醇的衍生物(NPD-103)进行了定性和定量,流动相为甲醇-0.1%甲酸(75∶25),NPD-103的回收率分别为95.58% (1.0mg/ml)、102.43%(5.0mg/ml)和97.77%(10.0mg/ml), 线性范围为0.1～20.0mg/ml(r=0.999)。MingDS等建立了UPLC-MS/MS测定人血清中氯氮平和去甲可待因浓度的方法,采用Acquity BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm, 1.7μm),甲醇-水(含0.2%氨水)为流动相,流速为0.40ml/min。YadavM等利用UPLC-MS/MS同时测定人血浆中洛匹那韦和利托那韦的浓度,并对36位健康印度人的生物等效性进行了研究。利托那韦和洛匹那韦的线性范围分别为2.9～1452ng/ml和29.6～14379ng/ml,平均回收率分别为97.5%和96.6%。Bhavesh D等利用UPLC-MS测定人血浆中非诺贝酸含量,以甲芬那酸为内标,线性范围为0.05～7.129mg/ml,定量限为0.05mg/ml,日内和日间精密度均小于9.3%,非诺贝酸和甲芬那酸的提取回收率分别为66.7%和52.6%,样品分析时间仅为1.8min。Berg T等建立UPLC-MS/MS测定尿中阿片类和可卡因含量,采用阳离子交换固相色谱柱对样品进行提取,以5mmol/L碳酸氢铵溶液(pH 10.2)-甲醇为流动相,对吗啡、可待因、6-乙酰基吗啡、吗啉吗啡、羟氢可待酮、乙基吗啡、可待因和苯甲酰爱康宁等成分进行了梯度洗脱。Licea-Perez H等利用UPLC-MS/MS同时测定人血清中的睾酮和5α-二氢睾酮,取血清300μl经甲基叔丁醚液液提取后,加入2, 3-吡啶二羧酸衍生化提高检测灵敏度,供试品溶液经固相萃取柱净化后进样,睾酮和5α-二氢睾酮的检测浓度分别为0.2～40ng/ml和0.01～2ng/ml。方法灵敏度高,专属性强,适用于睾酮的药动学研究。Cai S等利用UPLC-MS/MS测定人血浆中米格列奈含量,以那格列奈为内标,血浆经乙醚提取后进样,经AcquityBEH C18色谱柱(50mm×2.1mm, 1.7μm)色谱柱分离,流动相为甲醇-10mmol/L 醋酸铵(65∶35),流速为0.25ml/min。线性范围为1.080～5400ng/ml,最低检出量为1.080ng/ml。Hu X L等建立了UPLC-MS/MS定量测定健康人血浆中阿托伐他汀浓度及药物代谢动力学研究,血浆样品经磷酸酸化后,采用叔丁基甲醚提取,内标法(以格列齐特为内标)定量,并用于24名健康男性志愿者单剂量口服10mg阿托伐他汀钙片的药动学研究。该方法快速、灵敏、可靠,适用于阿托伐他汀钙临床用药监控和药代动力学的研究。Hermes Licea-P等利用UPLC-MS/MS结合带液液萃取及衍生化的半自动样品处理技术,同时检测人血浆中口服避孕药中乙炔基雌二醇(EE)与左炔诺孕酮(LN),其浓度范围分别为0.01～2ng/ml与0.1～20ng/ml。该方法将6min的检测时间缩短到2.7min,所需的血液用量也从500μl减至300μl,能成功用于药物代谢动力学研究。Yunsheng H等比较了各种快速液相色谱与质谱串联技术,同时检测大鼠血浆中低剂量(ng/ml)克拉屈滨和克罗拉滨含量的方法。得出结论为UPLC-MS/MS较HPLC-MS/MS方法,具有更高的灵敏度、更好的分离度、更快的速度、更高的经济价值及可靠性,同时也能避免母离子抑制效益。

    2. 4. 2　生化药品代谢产物的分析　

    Wang等利用UPLC-MS同时定量检测老鼠肝微粒体中7种单羟基睾酮代谢产物(16α-, 2α-, 7α-, 6α-, 2α-, 6α-,16α-羟基睾酮),该方法可用于检测生物基质中睾酮羟化酶的活性。Hiroki Kawanishi等利用UPLC-MS分析C3H/HeNCrj小鼠毛发中组胺(HA)及其代谢产物,探讨毛发周期与寿命的影响因素。该方法分析小鼠中组胺与其代谢产物如1-甲基组胺(MHA)等。手性荧光化试剂DBD-F标记HA,DBD-PZ标记代谢产物,利用该方法将衍生物分离分析。该方法具有良好的线性范围,组胺与其代谢产物的检测限分别为0.21、1.0、0.17和0.11pmol,小鼠毛干与毛根的组胺及代谢物浓度均被检出。该方法也能运用于毛发中其他各种化合物的分析研究。Ganfeng W等运用UPLC-MS/MS测定猴血浆中的SCH 503034非对映异构体。在APCI选择性反应检测正离子模式下,检测SCH 503034非对映异构体。线性范围均在1～2500ng/ml,批间平均偏差与相对标准偏差(RSD)分别为1.2%～3.6%与2.8%～10%。批内平均偏差与相对标准偏差(RSD)分别为1.3%～5.5%与2.3%～7.8%。异构体回收率在2.5、50和1000ng/ml水平时, 分别为87.2%～90.0%、89.1%～90.4%和92.3%～94.3%。定量限为1ng/ml。该方法具有更高的分析通量、灵敏度及分离度,不仅能用于猴血浆检测,还能检测小鼠、狗及人血浆样本。

    2. 4. 3　中药代谢产物的分析　

    随着天然药化、中药药理、中药分析等相关学科的发展,中药药物代谢动力学科逐渐成为现代中药学科研究的重要内容之一。由于中药组分复杂,有效成分多样化且含量低,UPLC具有高分离度,高灵敏度等优点,近年来越来越多的研究者采用UPLC - MS/MS技术研究中药化学成分的体内代谢转化。

    Wang X等使用UPLC-MS在多反应监测(MRM)模式下,建立了测定大鼠血浆中的双氢槲皮素。血浆样品在乙酸乙酯液液提取后,经Sunfire色谱柱(2.1mm×50mm, 3.5μm)分离测定,线性范围为6～6750ng/ml,日内和日间精密度均小于8%,回收率为92.9%～105.1%,最低检出限为6ng/ml,大鼠双氢槲皮素的绝对生物利用度为0.17%。Xi X Y等利用UPLC-MS/MS在正离子模式及多反应检测模式下,检测大鼠血浆中牡荆葡基黄酮-2’-O-鼠李糖苷(VOR)。线性校正曲线范围在10～2500ng/ml,定量限为10ng/ml。VOR平均萃取回收率为(97.2±2.6)%。该方法首次成功运用于口服单剂量(120mg/kg)的VOR药代动力学研究。对中药复方制剂的代谢研究中,Wang等利用UPLC-MS建立了中药复方茵陈蒿汤45个化合物的指纹图谱,以及该复方经口服进入小鼠体内后所产生的21个代谢产物的指纹图谱。进行比对发现,其中19个代谢产物是原形化合物,而6-甲氧基香豆素-7-羟基硫酸盐(6-methoxy coumarin-7-hydroxyl sulfate)和7-甲氧基香豆素-6-羟基硫酸盐(7-methoxy coumarin-6-hydroxyl sulfate)是6,7-二甲基香豆素(6,7-dimethylescu1etin)的两个代谢产物。UPLC-MS的高灵敏度、高分离度及高峰容量,可以为中药复方制剂的药代动力学及作用机理研究提供更多有用的化学信息。

    3　UPLC的局限性

    尽管UPLC能显著减少复杂样品的分析分离时间,提高检测的灵敏度和分离度,但目前UPLC的使用仍然存在局限性,其普及应用可能仍然需要一些时间。

    3.1　与UPLC匹配的色谱柱比较少　

    UPLC是应小粒径(小于2μm)柱填料的需求而专门设计的耐高压液相色谱系统,因此使用小粒填料的色谱柱能够最大限度地发挥UPLC高分离度和高灵敏度的优势。但是这种色谱柱要能够耐受由于粒径减小而带来的高反压,而且粒径的减小也给色谱柱充填技术带来了挑战。作为首家UPLC仪器开发商的Waters公司目前也只能提供有限型号的色谱柱(BEH C18 ACQ, BEH Shield RP18 ACQS, C8和苯基键合固定相等)。可喜的是,各大公司已在努力开发小粒径填料色谱柱。Nguyen D T等比较了已经上市的粒径小于2μm的色谱柱性能, 如Agilent公司的Zorbax Eclip se XDB C18(1.8μm), Zorbax Extend C18(1.8μm), Zorbax Stable Bond C18(1.8μm)以及Thermo Electron公司的Hypersil GOLD C18 HYP(1.9μm)等。这些色谱柱均能发挥小粒径填料的优势,且各有所长。随着色谱填料技术的不断革新,UPLC色谱柱型号缺乏的问题应该是可以克服的。

    3.2　峰面积的重复性欠佳　

    Novdkov L等发现,UPLC分析样品时峰面积的重复性略逊于HPLC,特别是低浓度样品时更加明显,其峰面积重复性的RSD约为HPLC的2倍。研究者认为,可能因UPLC的进样量过少(仅有2μl),或者由于采用了半环(partial loop)进样的方式,理论上这种进样方式的精密度不如全环(full lop)进样。通过稀释样品,增加注入样品的体积,可以改善这种状况。

    3.3　对高频检测仪器的需要　

    UPLC分离样品色谱峰扩展很小,通常峰底宽度只有几秒钟,低浓度的样品峰则更窄。O’Connor等发现,使用UPLC测定低浓度样品时,准确度、精密度都比较差。这可能是由于检测仪器探测频率比较低,检测低浓度样品时出现了样品点的遗漏。因此,随着UPLC的开发应用,必将推动高频检测仪器的进一步发展。

    4　展望

    UPLC作为一种新型液相色谱技术,延伸了液相色谱的应用范围。UPLC以超强分离能力和速度、超高灵敏度、与HPLC简单方便的方法转换、良好的质谱入口等特点为现代色谱分析开创了广阔的前景。其进样体积小,分离快,溶剂消耗少,为药物化学成分分析、药物合成分析、中药快速定性定量分析和体内代谢产物分析,提供了一种高效、准确的分析技术。充分利用UPLC的高分离效率和MS的高灵敏度与定性功能,能快速完成众多复杂成分的分离与鉴定。该联用技术既可建立中药或复方药物指纹图谱,又可进行多种有效成分或指标成分定量,还可用于体内药物分析。随着药物分析方法的发展,相信UPLC作为一种强有力的分析技术,将会在药物分析领域中发挥越来越重要的作用。