转膜:基因合成

上一篇 / 下一篇  2010-07-08 14:17:35

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转膜:基因合成
  Western 不同转膜方法的取舍
  小分子量的蛋白半干转效果比较好,
  大分子量(100KD)以上建议湿转。
  转膜:
  具体转膜条件需要多摸全基因合成一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2,1-1.5h 都可以,大分子湿转100V,2.5h以上应该可以,转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话,一般都能有结果。
  湿转,Buffer一定要预冷,最好提前一天配好放4度;滤纸不要大过PVDF膜,防止短路;胶在负极,膜western blot靠近正极,放入Tank前检查一遍会使你免以体 会放反的痛心疾首;膜要标记好正反面;转膜过程中,经常过去看看,防止意外,如电泳仪接触不好。
  显影:转膜后看和你的蛋白 实时定量PCR分子量近似的预染Marker有没有转过去,如果marker没问题,那基本可以认为你的蛋白转过去了。
  显色的话应该ECL好些吧,灵敏度更高呢,HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗,然后加ECL试剂,包好后压片,一般如果你能够看到荧光的话,压 片5min以内就可以看一下,如果看不见的话,直接压半小时吧。暗室中压片,压片完后显影、定影、水 引物合成探针合成洗,就可以了。要是对曝光时间没有把握,可以一次叠两 张胶片,相当于做个梯度。
  蛋白分子量大小分别为21kd、28kd,用的是湿转,请问多大电流,多长时间比较合适?
  解答:分子量比较小,最好是用干转,湿转效率太高,易转过了。干转的话,用2.5 A/cm2, 30min就应该够了。湿转,按照bio-rad的说明,用100mA,也得要半个多小时吧。
  转膜时何为湿法,何为半干法?
  解答:半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统,将膜,胶,滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的,叫湿法;用滤纸吸buffer来做 转移体系的叫半干法
  半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系,那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢?一般蛋白表达纯化的条件是怎样的?
  解答:半干转的电流大小是按照面积来算的,时间是根据蛋白分子大小定的;而湿转的话电流是恒定的,时间也是根据分子量而定。
  western显色的方法主要有以下几种:
  i. 放射自显影
  ii. 底物化学发光ECL
  iii. 底物荧光ECF
  iv. 底物DAB呈色
  现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章抗体通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就 行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。
  答:DAB 有毒,但是比较灵敏,是HRP 最敏感的底物;ECL结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。
  DAB好还是ECL好?

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