转膜:基因合成

转膜:基因合成
  Western 不同转膜方法的取舍
  小分子量的蛋白半干转效果比较好，
  大分子量（100KD）以上建议湿转。
  转膜:
  具体转膜条件需要多摸全基因合成一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。
  湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜 western blot 靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体 会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。
  显影:转膜后看和你的蛋白  实时定量PCR分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。
  显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压 片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室中压片，压片完后显影、定影、水  引物合成探针合成洗，就可以了。要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两 张胶片，相当于做个梯度。
  蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？
  解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2， 30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。
  转膜时何为湿法，何为半干法？
  解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做 转移体系的叫半干法
  半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有关系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般 蛋白表达纯化的条件是怎样的？
  解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。
  western显色的方法主要有以下几种：
  i. 放射自显影
  ii. 底物化学发光ECL
  iii. 底物荧光ECF
  iv. 底物DAB呈色
  现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章 抗体制备通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就 行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
  答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。
  DAB好还是ECL好？