质谱鉴定凝胶取点注意事项

上一篇 / 下一篇  2010-10-12 09:51:11

文章来源
  • 文章来源:转载
自己总结的关于凝胶取点的注意实现,觉得比较全面和详细,期望对即将要做质谱的朋友有用!
1,取点的时候最怕有皮屑等人体角质蛋白污染,所以,首先,第一点需要注意的是带口罩、手套、可以的话,还把头罩也带上,如果不带头罩的话,取点的时候,头不要刚好位于凝胶的正上部,不然头上的皮屑很容易掉进胶里,影响质谱鉴定
2,蛋白鉴定需要的蛋白量越多越好,所以尽可能把某一个点里所有的蛋白全部取到,不过某些非常大的点就只要去一部分就可以了。
3,酶解的时候有一步是凝胶脱水,脱水后的凝胶体积会大大缩下,甚至可以进入常用的0.2ml黄枪头的孔里,而如果小到这种程度的话,很容易导致酶解操作的时候不小心把点给带走弄丢甚至弄乱,所以取点的时候尽量取大块一点的区域,征对那些面积比较小的蛋白点,不妨把取点用的枪头孔径剪大一些,把该蛋白点的边上空白部分也一起取一些下来也不要紧的。
4,蛋白点的纯度越高越容易鉴定,一般双向电泳的点都是独立的蛋白,纯度完全满足鉴定的要求,但是有时候刚好碰到两个差不多的点非常接近甚至有部分交叉,取点的时候就注意不要取混合了,混合的蛋白点一般是没有办法进行质谱鉴定的(算法的选择问题)。
5,取完的蛋白点可以放在室温下保存1周左右,可以放在-20度或者-80度保存半年以上
6,取点的时候,把0.2ml的黄色枪头前面剪去一小部分,以增大孔径,将枪头垂直戳向凝胶上的蛋白点,然后旋转一下把点给戳下来,然后再转入0.5ml离心管里,离心管最好可以灭菌,不过如果不灭菌的话,影响也不大。另外在离心管里事先装点水,这样,枪头里的蛋白胶粒放在离心管里就很容易进入离心管中的水里了,如果蛋白胶粒还在枪头不下来的话,可以把枪头装到移液枪上,对着水吸打几次,就很容易下来了。
7,离心管里转水一个是让蛋白胶粒容易落下来,另外一个是起到对胶粒进行清洗的作用,清洗完以后,需要把水吸干,不要让胶粒一直泡在水里,不然胶粒里面的蛋白会慢慢扩散到水里,导致蛋白含量降低,影响鉴定。
8,另外,有些朋友担心一张胶上的蛋白点不够,所以经常会把几张胶上的蛋白点取了放在一起进行鉴定,这种想法的出发点是好的,但是其实没有必要,而且还会增加很多麻烦,降低质谱的成功率,增加的麻烦主要是增加了取点的麻烦,降低质谱成功率主要是因为胶粒在脱水的时候变得很小,在酶解操作的时候会不小心把一个管子里的胶带到另外一个管子里。碰到这种情况,如果只取了一个胶粒的话,大不了把这两个胶粒再分开,同时注明一下有可能两个样品搞混了,鉴定结果出来后再对照图谱看一下就可以了,但是如果是多个胶粒的话,就分不清楚了。
9,关于枪头的选择,有人喜欢用1ml的大枪头,个人觉得太大了,对于表达量比较大的蛋白还可以,对于稍微低一些的蛋白就会麻烦一些!而且0.2ml小黄枪头属于长锥体,可以很方便地在不同的位置剪开以获得不同孔径的枪头,而且也比较准确一些!
以上所有是个人的一点经验,欢迎大家补充!

TAG:

 

评分:0

我来说两句

显示全部

:loveliness: :handshake :victory: :funk: :time: :kiss: :call: :hug: :lol :'( :Q :L ;P :$ :P :o :@ :D :( :)

日历

« 2016-12-03  
    123
45678910
11121314151617
18192021222324
25262728293031

数据统计

  • 访问量: 147
  • 日志数: 1
  • 建立时间: 2010-08-03
  • 更新时间: 2010-10-12

RSS订阅

Open Toolbar