分析方法开发的四大要项

上一篇 / 下一篇  2010-12-01 10:30:23

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  大概在20年以前,美国化学学会出版的分析化学杂志刊登了一篇讨论分析方法开发的文章。这个杂志一般都是学术界发表文章。偶尔会刊登一些实用性的文章。这篇文章我记得非常清楚。讨论的就是分析方法开发的4S。这4S就是Specificity(专属性),Sensitivity(灵敏度),Speed(速度)还有就是$(费用)。其实任何分析方法开发,都需要考虑这4S。当初那篇文章也不知跑到那里去了,我就把我这几年工作上的经验,一起与大家分享。我相信很多大家一定都知道了。看看我说的是不是有道理。当然,还是希望大家加入讨论,分享大家的经验。

  分析方法首先要注意的就是专属性。所谓专属性就是我们分析某一个化合物,所得到的分析信号必须是完全来自於这一个化合物本身所产生的信号。早年色谱不那么的盛行,我们就试图使用各种方法,取得这个化合物专属性的信号。譬如光谱中的某一个波长只对这个化合物发生吸收。我们也可以利用这个化合物氧化还原的特性而能够从电极上产生信号。还有就是利用化合物本身在热化学产生吸热放热的信号。慢慢的我们的色谱开展了。因为色谱的开发,可以把要分析的化合物从一个混合物中分开,而取得这个化合物的专属性而进行定性定量。目前在美国,色谱的应用已经排在天平,pH 计成为第三位最常用的分析仪器了。我相信主要的原因就是色谱很容易的就能够提供各个化合物的专属性。简单的说,所谓取得专属性其实就是处理样品的基质 (Sample Matrix)产生的效应。如果把基质所造成的干扰除去,我们的分析物(Analyte)的专属性就自然出现了。也就是说我们可以化合物的对照品来定量定性。

  灵敏度就是借着调动仪器的组成(Components)使我们能够得到最大的信号。或者借着化学反应使分析物能够产生柱前或柱后的衍生物,来增加灵敏度。当然 我们谈到信号就要考虑到基线,也就是Signal/Noise 比例。就拿色谱来说,如果灵敏度高,我们所进样的样品量就小。想想一个最有效除去样品基质效应的最简单的办法就是稀释样品。所以,如果能够取得最高的灵敏度,实在是取得样品专属性一个最简单,又最快捷的方法。这也是我一再强调,当我们在做含量分析的时候,使用一个简单的等度,短时间的分离方法。然后尽量减低样品的进样量(但是需要考虑积分面积的重复性)。因为进样量小,即使有百分之一的杂质,恐怕也无法测出。当然,我们需要另外一个进样量大,时间長的梯度分离法来检测0.1%的杂质。在色谱方面,我们可以选择波长,也可以选择不同的检测器。看看我们用质谱来做微量的分析,以前繁杂的样品前处理程序都可以简化甚至省略,就是因为质谱的专属性及高灵敏度。

  再来就是分析的速度。分析的时间长短是质检工作的重要一环。一系列的样品及对照品能够在短时间内完成,自然避免许多不必要的困扰。在色谱方面,缩短样品分析的时间方法就是从保留时间着手。可以用C8的柱子就不需要用C18。因为这两种柱子的基本选择性是相同的。样品只要有足够的保留时间就可以了。使用C8同时也可以减少乙腈的消耗量。做等度分离,柱子的长度一般用15厘米,4.6毫米口径。重点是样品是否可以完全溶解到流动相。在液相色谱,样品的溶液是很重要的。如果非极性超过了流动相,样品的溶液就具有流动相的功能。使用15 × 4.6 的柱子做等度分离,进样量一般是不超过20微升。一般一个样品的分析时间最好在5到8 分钟之内。至於应用到工艺方面的控制,分析的时间就需要更短。甚至样品必须连续注射,不断的有结果出来。这就是我们一般说的Process Analytical Technique (PAT,工艺分析技术)。这几年美国FDA一直在要求PAT。主要的原因就是从就基本工艺,也就是制药的过程来品控。想想也是有道理的。我们一个批次做出的片粒有好几万,甚至几十万。结果到最后我们的取样量只是微不足道的一小部分。如何来证明这些少量的取样可以代表整个的工艺产品。所以,慢慢的各种光谱分析的技术将应用到每一片制剂的检验。可见分析速度的重要性了。

  最后就是花费了。分析样品的花费当然包刮了仪器本身,使用的各种化学试剂,人员的消耗,还有各种实验室运行的开销。就拿色谱来说,先期的投资购买最可靠,最耐用的仪器,自然是首要的条件。所谓工欲善其事,必先利其器。柱子也是一样。有了好的仪器,好的柱子,至少碰到问题的时候,可以帮助我们很快的摒除仪器与柱子这方面衍生的问题。基本上在做色谱发了问题,一个就是仪器部分,另外就是化学。仪器部分自然包刮了进样器,检测器,泵,数据系统,还有柱子。这一部分出了毛病,在美国一般的分析人员都是找仪器公司负责处理。一年的花费大概在一万美元左右,负责仪器的修护,保养,校正还有回答各种问题。一个电话,可以解决问题当时就解决了,不能解决的,修护人员24小时之内到达现场负责解决。柱子也有保险期。总之,时间就是金钱。一个分析的问题出现,分析员要立刻能够判断问题的症结所在而采取适当的步驺来解决问题。属于仪器部分的问题有仪器公司负责,其他的问题就得自己解决了。一个公司研究,开发部门的进展,和分析部门的运作是紧紧相扣的。如何彼此互相沟通,提高工作效率,自然是很重要的课题。以后再慢慢讨论。

  yuanhejun

  我先讨论下速度和费用的问题。个人觉得,其实分析速度也应该属于费用的范畴来考虑,是人力成本的费用吧。

  方法在开发过程中就应该考虑到方法的简便。过分繁琐的方法带来的是测量误差的增加,和人力成本的浪费。考虑包括了溶液配置,色谱系统,普通的色谱柱,出峰时间,分析时间等等。生产过程中,分析时间越短,得到的数据越快,降低了整个生产的风险。有次陪同一个专家去做残留溶剂的培训。当讲到该方法需要 70分钟的分析时间时,该同志就把这个方法狠狠的批评了一番,虽然他是来给用户做该方法的培训的。末了,他推荐用户自己去开发方法吧。超过10分钟的分析时间是令人抓狂的。

  花费。由于整个分析过程是很复杂的,多因素的影响。要求分析员能迅速地判断问题的来源是非常困难的。例如峰型差,是流动相,天平,ph计,进样器,柱还是别的原因,又包括了分析员在整个操作过程中是否有偏差存在。能迅速判断问题的分析员,是具备了良好的知识储备和丰富的经验的。

  接着谈到仪器的保养和验证。这是一笔很大的费用。平均每一年一次的PM和验证的费用超过了仪器10%的价格。还要花费大量的人力和物力去管理和操作。可分析部门几乎是与所有的研发部门扣在一起的。它的风险也非常大。例如一台天平停止工作,将会使分析部门彻底停工,其他部门就只能等待,又例如天平存在很大的偏差,那所产生的所有的数据都要重新评估。如此产生的后果是不可想象的。所以我们在考虑费用的时候,不能仅仅想的是如何节省。就像作者所说的, “平衡”。

  ccyting

  我是百分之百同意“平衡”的说法。在分析方面不论多大的开销,跟人力比较起来都算是小数子。因此,一般实验室配备的永远都是有额外的各种仪器,以防备因故障而浪费人力的情形。换句话说,仪器坏了,还有后备的可以使用,但是要人员因为仪器故障而闲下来,那是不可原谅的管理失误。我说到节省,慢慢的变成一个重要的环节。举例来说,我们用下来的乙腈,处理五加仑(20升,包含水或其他的有机溶剂)的价钱大概要350美元左右。而且每年在增加。所以我说能够用C8就不要用C18。很早以前就已经提倡回原使用乙腈的流动相。好在目前至少色谱仪器的使用时间很长,有的过了20 年还照样运转。看看美国大学研究所教授用的仪器,还一样在用。记得时常看到杂志上报导在做色谱花费,最大的就是仪器本身的购买,保养,认证等等,还有就是人员的花费。

  天赏人间

  就专属性有个想法:专属性不应该只限定在用完全分离来保证。质谱检测器选择离子检测时可以定量未完全分离的成分;相应的,紫外检测器下选择不同的检测波长也可以排除干扰;如果继续扩展一下,当未分离的干扰成分和待测成分浓度差异很大(或者对检测器的差异很大)时,那么将样品溶液稀释至一定的倍数,也应该可以排除这种(对定量)的干扰,不知道这个观点目前是否能被认可,或者再俗一点,审评中心能不能接受。

  ccyting

  早年我们做分析方法就是提倡两种方法一是所谓的低进样low load 另外就是高进样high load。低进样的原理就是可以通过稀释,避免存在的干扰出现。高进样是去查看杂质等有关物质。不管国内国外,审评中心不同意总得给个不同意的说法。在美国还没有听说过不同意的。至少我经手的四个NDA都过了。

  天赏人间

  现在和CDE基本上不打交道了,几年前有过类似的情况——众所周知,在复杂的复方中药中要想完全排除某些干扰 (特别是极性较大的成分)几乎是不可能的;或者,某些特殊的赋形剂也可能影响主峰的测定——由于常量分析下对分析方法的准确度和精密度要求较生物样品测定等更高,这种干扰经常会带来困扰。当时的解决方法一般是在干扰的影响低于1%的情况下会选择稀释后测定,但是CDE的意见通常就是:建议研究单位继续考察色谱条件,以排除主峰位置的干扰,所以想咨询一下比较现实的案例——如果不涉及商业秘密的话。

  比如说:某浓度下主峰的峰面积是10000,而干扰峰的峰面积是100,此时干扰峰的信噪比是20;如果稀释20倍,理论上应该不再有干扰——同时,理论上此时峰面积为500的主峰信噪比仍然数倍于20,即可以符合定量的要求。所以应该是排除了干扰的。如此的解释,通常CDE是无视的。但是另一方面,这样的情况也可能意味着当绘制标准曲线时,高浓度下主峰中存在了干扰,因而可能导致线性的偏差,这样看似乎又不能完全排除干扰。

  ccyting

  我很能体会您的问题。复方的色谱我看过几个,的确存在您所说的情形。这也是我在写本篇讨论时没有考虑过到问题。您的提出,的确帮助了我的思考。我之所以提low load 方法,实际上并没有考虑到复方主峰的存在。一般化学药品主峰的纯度都在99%左右,所以主峰下存在其他杂质的情况是很难出现的。如果有了复方主峰干扰的情形,稀释可以应一时之急,但是基本上的同一时洗脱(co-elution)的问题还是存在的。所以,最近色谱一再强调Capacity的问题。就是在一个色谱定时间内到底可以分出多少峰。基本上,我还是认为要想办法把主峰分开。换柱子。最近沃特斯有一个柱子SunFire 就是Capacity比较大的柱子。如果一度空间分不出来,就要用两根柱子,把第一根柱子转换到第二根柱子。这就是所谓 Two Dimensional Chromatography 也就是所谓 Column Switching Technique。20年以前我还拿到一个这方面分析技巧的专利。目前美国 University of Minnesota 化学系教授Peter Carr 还是我研究所的同学,这几年发表一系列的文章。就是如何增加Peak Capacity 也就是如何增加分离度。也就是说把一个主峰从一根柱子转到另外一根柱子再行分离。做起来并不难。就是加一个six port valve。这些问题都是可以解决的。

  天赏人间

  继续分离我尝试过,我现在采用的方式是用几支Chromolith串起来——相对改动仪器,成本低一些,但那结果仍然就是“无限可分”。所以有时候面对3支甚至更多的色谱柱串在一起,却仍然能分离出N多的东西,会产生这样一种困惑:分析方法在准确精密的同时,效率和成本也同样重要,对于一些可以通过检测器的选择性和稀释降低基质干扰的情况,追求完美的分辨率到底有多大的价值。

  相柱切换技术这样的,是否科研意义更大于实际推广的价值?我一直认为色谱分析应该是一种可推广、具有很高实用价值的手段。

  ccyting

  我的感觉是我们可以借着使用多柱子来增加分离度,但是有一个先决条件就是样品本身的特性要了解清楚。譬如我们在做药动样品的时候,必须先把蛋白质给除掉,或者经过固态萃取样品前处理。这样对于同一类化合物,我们可以用不同方式来增加分离度。但是如果像中药复方样品,我们可能就把不同类的化合物放到一个固定的柱子及流动相,自然可以想象分离的困难了。如果有高分子的化合物存在,然后又与小分子在同一保留时间洗脱出来,而这些高分子本身就会有宽峰的出现,自然无论如何努力,恐怕用一根同样的柱子要完全分开是有困难的。因此,样品先前的处理就必须考虑了。想想看,目前的柱子的效率等等都年年在改善进步。要分离同类化合物不是一个难题。基本上只要改用流动相都应该可以解决。而且经过对於流动相酸碱度的控制,加上目前又有耐酸耐碱的柱子,分离不应该是难题。您提到的Chromolith柱子倒是过去10年开发出来的。我自己没有用过。到是希望知道与一般柱子的比较。

  pfizer2001

  现实的情况是我们的废液都会倒在下水道,我们自己都感到害怕,但是给环保部门联系,他们呢置之不理。而关于前一段时间讨论如何削减乙腈等有机溶剂的费用,我在国外的一个论坛上看到,其实比起溶剂的消耗人力成本可能占据更大的费用。但是国内就不一样了,但是我想在 US可能废液的处理成本也会相对的高昂吧!

  至于楼主说的2D分离,最近也很热门,或许以后会成为标准里通用的方法,但是按照我的观点,只要能够达到控制药品质量的要求就可以了!而中药以及复方药品的质量控制目前也没有好的办法,至于中国药典上给出一个下限,而且一个并不一定是有效成分的下限,在我工作的几年内发现效果几乎没有。因为不同厂家的含量差别可能有10倍甚至更高。

  我想问一下前辈,我和国外的同行聊天的时候讨论指纹图谱的问题,但是他们给出的观点说这个方法根本没有可行的。不知道你的意见怎么样?毕竟2010年药典已经收录了这个方法!

  ccyting

  废物的处理的费用是相当高昂。实验室内产生的垃圾都必须当作废物处理。最近我的实验室找废物处理公司处理了一个 55加仑大桶内装的实验室垃圾(譬如手套,一次用吸管,等等),一个5加仑的有机溶液。费用一共是750美元。可是这是必须的。另外就是生物实验的废物是另外一种公司负责。费用也是不贵。

  关于分析方法的要点是要能够重复。不管使用何种方法,要时时想到方法的重复性。不但是在自己的实验室,而且转换到其他实验室,也要很容易重复。方法复杂了,自然重复就比较困难。因此为啥要强调,减少人为操作的程序(自动化,automated) 来增加重复性的机会。

  我们测定方法的可行性就是用标准品开始,所以有所谓的系统适合性等等。中药的复方是复杂的。这里面牵涉到的不止是方法的问题,主要是药材的控制。不是不可行,而是要首先控制药材。就像我们做化学药,原料药的重复性是首要的。有了控制化学原料药的办法,才能谈到最后药品的控制。

  我想总是一个阶段一个阶段进步。美国环保署好像是在73年才成立的。一直到了80年代中期,我们实验室才禁止把废弃有机液排入地下水的。当初甲苯是个多么平常的溶剂,也随时倾倒。现在是严格管制使用。随着改革开放,环保意识的抬高,这些都会慢慢禁止的。也应该禁止。我以前工作的一个公司,在60年代把多氯苯环的化合物放在大铁桶里,埋在地下。经过多年的腐蚀,有机废物就流到地下,变成地下水。结果附近的居民很多得了癌症。诉求公司的赔偿都是上亿。今天不注意这些,日后造成的灾害也不是金钱所能弥补的。


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