转-液相色谱经验维护篇

上一篇 / 下一篇  2010-08-26 14:20:44

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第一篇 基础篇

  液相色谱使用及维护相关知识

  HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成.有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、柱温控制器等。

  一、 输液泵

  1. 泵的构造及原理

  目前高效液相输液泵多用柱塞往复泵,一般都采用双泵补偿法。如图所示:

  泵1的缸体容量是泵2的两倍,两者的柱塞运动方向相反。泵1吸液时,泵2排液;泵1排液时,泵2吸取泵1输出量的1/2,这样往复运动,保证输液的连续性。

  2. 泵的使用及维护注意事项

  泵使用时要注意:

  a.防止固体微粒进入泵体,泵的入口都连接有砂滤片(或棒),滤器要经常清洗或更换。

  b.流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲液的流动相不应保留在泵内,尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内,由于蒸发或泄漏,甚至只是由于溶液的静置,就可能析出盐的微细晶体,会增加泵头内的宝石活塞杆和活塞的磨损。

  c.泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完,否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环,最终产生漏液。

  d.流动相应该先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定性,如果有大量气泡,泵就无法正常工作。

  泵的一般故障排除:

  a.没有流动相流出,又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体,这时可打开泄压阀,使泵在较大流量(如3ml/min)下运转,将气泡排尽,也可用一个针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损,需更换。

  b.压力和流量不稳。原因可能是气泡,需要排除;或者是单向阀内有异物,可卸下单向阀,浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡,或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞,这时,可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡,或将砂滤棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)内迅速除去微生物,或将盐溶解,再立即清洗。

  二.进样器

  HPLC进样方式可分为:隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

  1.隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内,可把样品直接送到柱头填充床的中心,死体积几乎等于零,可以获得最佳的柱效,且价格便宜,操作方便。但不能在高压下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应,使进样重复性只能达到1~2%。

  2.停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染,停泵或重新启动时往往会出现"鬼峰";另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中,效果较好。

  3.阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀 。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时,进样量应不大于定量环体积的50%(最多75%),并要求每次进样体积准确、相同。②用完全装液法进样时,进样量一般定量环体积的3~5倍,这样才能完全置换定量环内的流动相,消除管壁效应,确保进样的准确度及重复性。

  六通阀使用和维护:①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤,以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢,更不能停留在中间位置,否则流动相受阻,使泵内压力剧增,甚至超过泵的最大压力;再转到进样位时,过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中,每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗,或先用能溶解样品的溶剂冲洗,再用水冲洗。

  三.色谱柱

  柱的使用和维护:

  ① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行。

  ② 应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂直接改变为水相。

  ③ 一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

  ④ 选择使用适宜的流动相(尤其是pH),以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱,分析柱与预柱填料相似。

  ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积至少应是柱体积的5倍以上。

  四.检测器

  UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器,主要性能指标: 1)噪音和漂移:在仪器稳定之后,记录基线1小时,基线带宽为噪音,基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性,及其受温度和电源变化的影响,如果有流动相从色谱柱流入检测器,那么它们还反映流速(泵的脉动)和溶剂(纯度、含有气泡、固定相流失)的影响。

  2)灵敏度(sensitivity):表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。

  3)检测限.检测器灵敏度的高低,并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低,因为在定义灵敏度时,没有考虑噪声的大小,而检测限与噪声的大小是直接有关的。检测限是检测器的一个主要性能指标,其数值越小,检测器性能越好。

  检测器的故障及排除

  1)流动池内有气泡

  如果有气泡连续不断地通过流动池,将使噪音增大,如果气泡较大,则会在基线上出现许多线状"峰",这是由于系统内有气泡,需要对流动相进行充分的除气。

  2)流动池被污染

  无论参比池或样品池被污染,都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池,要注意溶剂的互溶性;如果污染严重,就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗,或者取出池体进行清洗。

  检测器对温度有一定的敏感度。紫外检测器一般在温度波动超过±0.5℃时,就会造成基线漂移起伏。

 
 
 
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原 因        解决方法
1、样品中有其他组份        1、正常
2、前一次进样的洗脱峰        2、a、增加运行时间或梯度斜率
b、提高流速
3、空位或鬼峰        3、a、检查流动相是否纯净
b、使用流动相作为样品溶剂
c、减少进样体积
J、           保留时间波动
原 因        解决方法
1、温控不当        1、调好柱温
2、流动相组分变化        2、防止变化(蒸发、反应等)
3、色谱柱没有平衡        3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
K、        保留时间不断变化
原 因        解决方法
1、流速变化        1、重新设定流速
2、泵中有气泡        2、从泵中除去气泡
3、流动相选择不恰当        3、a、更换合适的流动相
b、选择合适的混合流动相
L、         基线漂移
原 因        解决方法
1、柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)        1、控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器

2、流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。)        2、使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体        3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用盐酸)
4、检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)        4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化        5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时        6、用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成        7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂
8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。        8、使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂,但检测器未调整。        9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。        10、将波长调整至最大吸收波长处
M、       基线噪音(规则的)
原 因        解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气        1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液
图        2、见第三部分。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。
3、流动相混合不完全        3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)        4、减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备        5、断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。
6、泵振动        6、在系统中加入脉冲阻尼器
N、        基线噪音(不规则的)
原 因        解决方法
1、          漏液
图        1、见第三部分。检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成        2、检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶        3、选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题        4、断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。
5、系统内有气泡        5、用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡        6、清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。)        7、用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池
8、检测器灯能量不足        8、更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞        9、更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常        10、维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置
O、        宽峰
原 因        解决方法
1、流动相组成变化        1、重新制备新的流动相
2、流动相流速太低        2、调节流速
3、漏液(特别是在柱子和检测器之间)        3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确        4、调整设定
5、柱外效应影响
a、柱子过载
b、检测器对反应时间或池体积响应过大
c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
d、记录仪响应时间太长
图        5、
a、 小体积进样(例如:10ul而不是100ul)以1:10或1:100的比例稀释样品
b、减少响应时间或使用更小的流通池
c、 使用内径为0.007-0.01的短管路
d、减少响应时间
6、缓冲液浓度太低        6、增加浓度
7、保护柱污染或失效        7、更换保护柱
8、色谱柱污染或失效,塔板数较低        8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷        9、打开柱入口,填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰        10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低        11、提高柱温。除非特殊情况,温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大        12、使用较小的时间常数
P、         分离度降低
原 因        解决方法
1、流动相污染或变质(引起保留时间变化)        1、重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞
图        2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。
Q、        所有的峰面积都太小
原 因        解决方法
1、检测器衰减设定过高        1、减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大        2、设定较小的时间常数
3、进样量太少        3、增大进样量
4、记录仪连接不当        4、使用正确的连接
R、        所有的峰面积都太大
原 因        解决方法
1、检测器衰减设定过低        1、采取较大的衰减
2、进样过多        2、减少进样量
3、记录仪连接不正确        3、正确连接记录仪
以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。
A、        手动进样阀,转动不灵
原 因        解决方法
1、转子密封损坏        1、更换或调整转子密封
2、转子太紧        2、调整转子的松紧度
B、         手动进样阀,载样困难
原 因        解决方法
1、进样阀安装不当        1、重新安装
2、定量环阻塞        2、清洗或更换定量环
3、进样器污染        3、清洗或更换进样器
4、管路阻塞        4、清洗或更换管路
C、        自动进样阀,不能转动
原 因        解决方法
1、无压力(或电源)        1、提供恰当的压力(电源)
2、转子太紧        2、调整转子的松紧度
3、进样阀安装不当        3、重新安装
D、        自动进样阀,其它问题
原 因        解决方法
1、阻塞        1、清洗或更换阻塞部件
2、机械故障        2、见随机维修手册
3、控制器故障        3、维修或更换控制器
由气味、景象和声音可以发现的问题
你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯,每天花上几分钟运用你的感官(除了味觉)来“感觉”你的液相色谱是否存在问题,这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如:在你看到漏液之前,你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。
 
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A、        溶剂的气味
原 因        解决方法
1、漏液        1、见section 3
2、溅出        2、a、检查废液瓶是否已满
b、找到溅出的部位并清洗干净
B、         热气味
原 因        解决方法
1、仪器过热        1、a、检查并调节通风设施
b、检查并调节温度设定
c、关掉仪器,查找维修手册
C、        读数不正常
原 因        解决方法
1、压力不正常        1、见section 2
2、柱温箱问题        2、
a、检查并调节设定
b、参照用户手册
3、检测器灯失效        3、更换灯
D、        灯警告
原 因        解决方法
1、压力超出极限值        1、
a、检查是否阻塞
b、检查并调节极限值的设定
2、其它警示灯        2、见用户手册
E、         警告音
原 因        解决方法
1、溶剂泄漏/溅出        1、找到并解决
2、其它警告音        2、见用户手册
F、         刺耳的短音或长音
原 因        解决方法
1、轴承失效        1、见用户手册
2、润滑不够        2、进行恰当的润滑
3、机械故障        3、见用户手册
常见故障及日常维护
下表中列出了液相色谱常见的一些问题,右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。
溶剂瓶
问 题        维 护
1、进口筛板阻塞        1、
a、更换(3-6个月)
b、过滤流动相,0.5u滤膜
2、气泡        2、流动相脱气

问 题        维 护
1、气泡        1、流动相脱气
2、泵密封损坏        2、更换(3个月)
3、单向阀损坏        3、过滤流动相,运用在线过滤,准备备用单向阀
进样阀
问 题        维 护
1、转子密封损坏        1、
a、不要拧的过紧
b、过滤样品
 
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  第五篇 常见问题解决

  关于HPLC的常见问题及解答

  一、问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?

  答:关于漂移问题:

  1. 温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定

  2. 流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

  3. 柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡

  关于快速变化问题

  1. 流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定

  2. 泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。

  3. 流动相不合适,解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

  二、问:液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?

  答: 1. 筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子。

  2. 存在干扰峰,解决办法为使用较长的柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子

  三、问:HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

  答: 1. 样品量不足,解决办法为增加样品量

  2. 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

  3. 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

  4. 检测器衰减太多。调整衰减即可。

  5. 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

  6. 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

  7. 检测池中有气泡。解决办法为排气。

  8. 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。

  9. 流动相流量不合适。调整流速即可。

  10. 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。

  四、问:做HPLC分析时,柱压不稳定,原因何在?如何解决?

  答:原因可能有:

  1. 泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理;

  2. 比例阀失效,更换比例阀即可;

  3. 泵密封垫损坏,更换密封垫即可;

  4. 溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法;

  5. 系统检漏,找出漏点,密封即可;

  6. 梯度洗脱,这时压力波动是正常的。

  五、问:我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高,请问为什么?

  答:柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,您可按下面步骤检查问题的起因。

  1. 拆去保护预柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查;

  2. 把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再检查;

  3. 将柱子的进出口反过来接在仪器上,用10倍柱体积的流动相冲洗柱子,(此时不要连接检测器,以防固体颗粒进入流动池)。这时,如果柱压仍不下降,再检查;

  4.更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高,请与厂商联系。一般情况下,在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题,SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
 
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  第六篇 清洗总结

  HPLC系统的酸清洗和钝化

  30%磷酸水溶液通过酸反应和强表面活性剂/洗涤剂的共同作用,可以有效地清洁不锈钢及其它润湿的部件。这一方法比更常用的硝酸“钝化”绝对更有效、且较少损害(特别是对日常使用低紫外波长的应用来说)。这一磷酸清洗步骤不是起钝化作用,但它是系统钝化前清洗的第一步。一般来说,对于阳离子的离子色谱分析或配有氧化方式的电化学检测器以外的应用不需要钝化系统。因为有真空脱气机(每个通道体积为8m1),可不必用磷酸;中洗全部通道。如果你计划四个通道都要用,则可用湿灌注的方式以4mL/min流速对每个通道清洗8~1 O分钟来清洗脱气机。这一步完成后你必须彻底淋洗管路,用水淋洗2~3次以便将磷酸从溶剂过滤头等部件冲洗净。

  安装好的H P L C系统的酸清洗和钝化

  HPLC系统内部可能的污染物来自人的触摸,暴露在实验室化学环境,与零部件制造相关的残留物,或来自先前的流动相和样品的残余物。

  虽然系统自身也会逐步地被流动相清洗,但某些释放出的杂质会吸附在色谱柱上以及检测器润湿的表面上,因而会降低总的性能。

  •磷酸清洗:

  通常用于从系统中除去有机杂质。可能是由于洗涤作用,它似乎比强有机溶剂更好也更快。这一步清洗必须在硝酸钝化之前完成。

  •硝酸钝化:

  实际上是作用于不锈钢表面,在表面上生成均匀的氧化层。这层氧化膜保护不锈钢免受腐蚀(卤化物,螯合剂,等等)并且尽量减少浸出的金属离子进入流动相。

  以下应用需要在使用前做磷酸清洗和硝酸钝化,包括:

  •所有的氨基酸分析系统

  •所有包含电化学检测器的系统

  •所有要分析无机阳离子,包括过渡金属的系统

  •所有利用柱后添加衍生试剂或络合样品组分的系统

  以下应用需要在使用前只做磷酸清洗,包括:

  •所有常规用途的、可能在低pH环境下在低紫外检测波长下运行的HPLC系统

  •所有需要高灵敏度性能的梯度紫外检测系统

  系统清洗指南:

  注意:在实行这个程序时采用适当的安全防护措施

  准备工作:

  首先,摘下色谱柱,用两通或接头取代色谱柱。在实行这一清洗步骤时,如果有可能选择监测的紫外波长为:254nm。通过软件或移去电缆的方式取消紫外检测器的自动回零功能。

  具体步骤:

  1、用甲醇彻底冲洗系统,以等比例方式通过泵的所有管路。

  2、用水彻底冲洗系统,以等比例方式通过泵的所有管路。

  3、以等比例方式通过泵的所有管路导入~30%v/v磷酸水溶液。以1mL/min流速洗大约一个小时。在冲洗期间活动所有的阀,包括:参比阀、进样阀及旁路阀等等。

  4.用水彻底冲洗所有管路和系统。

  必要时用6N硝酸(HN03)重复以上步骤。否则,跳到第7步。注意:硝酸是一个强紫外吸收溶液。除非绝对需要,不要做钝化程序

  5.以等比例方式通过泵的所有管路导人6N硝酸水溶液(大约是40%)。以1mL/min流速洗大约一个小时。

  6.用水彻底冲洗系统,仔细检查是否有任何渗漏,在冲洗期间反复活动所有的阀,包括:参比阀、进样阀及旁路阀等等。

  注意:如果你要用低于270nm的紫外波长作检测,则需要更大量水的清洗过程,不断的换新鲜水并活动各个阀(冲洗进样器,等)以便从系统中除去所有的痕量硝酸根离子。硝酸清洗后经常在几天之内都会观察到在低紫外波长下有负的基线漂移。勤换水和有耐心是尽快消除紫外本底的关键。

  7.返回到甲醇洗,然后继续用实验所需的溶剂冲洗。


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c4frank 引用 删除 c4frank   /   2010-08-26 16:49:56
楼主,你下面的资料看不到啊。。很乱。。
 

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