核酸扩增试验用于狂犬病的生前和死后诊断

上一篇 / 下一篇  2011-05-05 11:48:11

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  狂犬病实验室诊断,目前最可靠的方法仍必须取犬(或人)的脑组织进行检测,这就是说,要快速确诊狂犬病必须要立即将犬处死。WHO认为:“除非是濒临灭绝的物种,否则对任何怀疑是狂犬病的家畜和野生动物,都应人道主义处死,采用正确的实验室技术检查动物组织中是否存在狂犬病抗原。”

  关于狂犬病的生前诊断,本文作了一些探索。由于问题尚多,作者也不推荐将NAT作为动物狂犬病毒的主要诊断工具。NAT用于生前诊断,必须能检测极低水平的病毒RNA,要求方法特别灵敏,因而更可能出现交叉污染。加之狂犬病毒在生物体液(比如唾液、脑脊髓液、尿液)中的排出具有间歇性,必须多次重复采集样品,难于作出可靠判断。

  摘要

  核酸扩增试验(NATs)在敏感性、特异性和快捷等方面正稳步提高。NATs可用于狂犬病的诊断、区分不同的毒株,还可用于鉴定新的狂犬病毒。同诸如直接荧光抗体试验等传统方法相比,NATs更有优势。它可以应用于液体样本和已经基本腐烂的脑组织的检测,也可作对诊断为疑似狂犬病人的确认或排除的一种替代手段。在某些实验室,实时PCR法比逆转录PCR法更受欢迎。巢式或者半巢式的二轮PCR,已经用于生前诊断,以检测低水平的RNA。本文回顾了妨碍检测的一些细节问题,以及如何正确使用NATs(包括样本的制备、核酸扩增技术、扩增靶位和引物设计等),并解释了最近的一些研究结果。

  关键词 生前 检测 诊断 核酸扩增 PCR 死后 狂犬病 实时PCR

  狂犬病仍属一种被忽视的疾病,尤其是在亚洲和非洲的犬狂犬病流行地区。据WHO估计,全世界每年死于狂犬病的有55,000人(其中仅印度就有30,000人)。由于一些狂犬病流行地区并未提交任何死亡报告,因此实际上每年的狂犬病死亡人数还会更高。数据被低估很容易解释:在许多国家,尤其是那些缺乏可靠的诊断设施的国家,狂犬病患者无须申报。因此,世界上大部分的狂犬病诊断仅根据临床数据,这是不可靠的。这将影响人们对于该疾病重要性的认识,并导致决策者的判断失误。

  越来越多的人已经认识到,人类狂犬病有不同的临床表现。经典的表现是狂躁和麻痹。尽管人类对麻痹型狂犬病的认识已有数十年,却依然出现导致组织或器官移植的误诊。麻痹型狂犬病通常和格林-巴利综合征、虫媒病毒引起的类似小儿麻痹症的疾病相混淆。甚至在狂躁型狂犬病病例中,也不一定会出现诸如恐水性痉挛的典型症状。发病阶段(早期或昏迷期)、病毒基因型的种类和病毒的不同变种的属性(尽管同属于基因I型,也可能分别来源于狗或蝙蝠)、不完全的病史资料、缺乏咬伤暴露史和对该疾病的察觉,都会使得医生在面对狂犬病患者时,难于作出判断。此外,与蝙蝠和狗狂犬病毒有关的非典型临床表现也已有报道。

  狂犬病死后诊断对于制定防控计划、流行病学监测、确定预防措施都是十分必要的。狂犬病死后诊断的金标准,是使用直接荧光抗体试验(DFA)对脑组织涂片标本进行检测,直接快速免疫组化试验(dRIT)可作为替代试验,狂犬病毒组织培养感染试验(RTCIT)、小鼠接种试验(MIT)或者ELISA技术等可作为确认方法。这些检测方法的敏感度可能会降低,尤其是当用于检测的脑组织腐烂之后。如果发生这样的情况,则核酸扩增试验(NATs)与DFA/MIT相比灵敏度更高、更适用。NATs与DFA特异性相同,NATs比MIT和RTCIT更快速且灵敏度更高。当DFA的结果为阴性的时候,NATs能够代替RTCIT和MIT,确认结果是否为阴性;还能够检测液体中的病毒RNA,用于人类的生前诊断;而DFA却不能。

  为了使其他可能暴露和需要狂犬病暴露后预防(PEP)的人得到警示,也为了预防含病毒的生物体液由病人向医护人员扩散,生前诊断的确诊是迫切需要的。曾经由于对一位麻痹型狂犬病人的误诊,使得超过200名医护人员不得不接受狂犬病暴露后预防(PEP);该病人住院9天后才被怀疑是狂犬病,并经核酸序列扩增试验(NASBA)得到确诊。早期诊断也可减少不必要的调查和不适当的治疗。目前,还没有治疗狂犬病的有效方法,对狂犬病的明确诊断,可能避免相关的组织或器官移植。

  狂犬病的实验室诊断在某种程度上可以说是难度最大的,必须由有经验的专职人员来完成。在本文中,我们简要介绍几种已经建立的狂犬病毒核酸检测方法,包括反转录PCR(RT-PCR)、反转录半巢式PCR(RT-hnPCR)、反转录巢式PCR(RT-nPCR)、实时PCR、等温扩增和微阵列技术等。

  NAT样本制备

  样本类型和收集

  尸体样本

  脑组织是人类和动物狂犬病死后诊断最适合的组织。但是在许多国家,由于宗教信仰问题和医生自身的抵触情绪,狂犬病生前脑部活检诊断不被接受,打开脑部进行尸体剖检也通常被拒绝。用Trucut针经由眼眶,或者用腰椎穿刺针经枕骨大孔收集脑组织,进行尸体剖检,也是一种替代方法。

  在温暖气候下,脑组织会迅速腐烂。当脑组织腐烂时,DFA检测结果通常为阴性,但使用RT-PCR仍可以检测到狂犬病毒RNA。在检测腐烂脑组织狂犬病毒RNA方面, RT-hnPCR比RT-PCR更灵敏。然而,与检测保存在-20℃的样本相比,这两种方法的灵敏度都会有所下降。在1998年到2000年间,对从以色列收集到的十个腐烂的脑组织样本进行检测,DFA的检测结果为阴性,而使用RT-PCR时结果却是阳性。用RT-PCR对常温下(25-27℃)放置的鼠脑组织样本进行检测,从第12天开始,PCR条带亮度有所减弱。直到第23天,RT-PCR依然可以成功扩增出狂犬病毒基因组,但对于DFA试验仅仅能检测出保存时间在7天以内的阳性样本。实际上,样品在室温(37℃)或者更高的温度下放置72-360h,对这些降解脑组织检测的灵敏度会发生改变(75%-100%)。

  核酸扩增试验同样适用于脑组织样本的检测,包括来源于滤纸、福尔马林固定和石蜡包埋的脑组织。滤纸可以用来收集脑组织样本,并在室温下保存222天以上,经NASBA(n=10)检测后还能够保持100%的灵敏度和特异性。在接触FTAR纸后两小时,狂犬病毒便丧失感染性。检测CSV-11狂犬病固定毒株的0.0016 TCID50(半数细胞培养感染剂量)时,RNA在滤纸上固定后,进行RT-hnPCR,与用标准的RT-hnPCR相比较,两者的灵敏度完全一致。在FTA纸固定和冷冻处理的样本之间,并未发现明显的核苷酸序列差异(584个核苷酸的序列中有99%是相同的)。已经保存的一些样本的NATs试验结果,提供了可供回顾的流行病学珍贵数据。福尔马林固定和石蜡包埋的脑组织,室温下放置16年,通过PCR仍能检测出狂犬病毒的核蛋白(N)基因(取自7名病人的30个样本中有20个结果为阳性),但是那些原来免疫组化试验为阳性的样品所得到的结果却不全为阳性。对于经福尔马林固定和石蜡包埋处理的人类脑组织,需要取不同部位且每个部位不止一个样品,才能获得正确的诊断。对冷冻的狂犬病感染的脑组织样本N基因的1432个碱基序列进行分析,结果与经福尔马林固定24小时和石蜡包埋1个月后的样本具有100%的一致性。

  生前样本

  在各种生物体液,诸如唾液、脑脊髓液(CSF)、泪液、尿液等样本中均可以检测到狂犬病毒的RNA,另外在有毛囊的颈部皮肤中也存在。当结果为阴性时,最好准备一个以上的生前样本,而且要在同一时间重复检测三次。病毒在生物体液(比如唾液、脑脊髓液、尿液)中排出具有间歇性。根据我们的实验,新鲜收集的1-2ml尿液的NATs结果应该比冰冻样本的检测结果更为可靠。使用NASBA可检测出患者毛囊中的狂犬病毒RNA,如果其它的样本不容易获得,这也是一种不错的实验材料。泪液也可能含有病毒,这点已通过RT-nPCR在至少一名患者身上得到证实,而用DFA和RT-nPCR对角膜印片和脑脊髓液进行检测,结果都是阴性。这进一步说明了使用提取的毛囊或者泪液作为检测来源是值得的。

  Dacheux等对43名病人进行的大量研究,发现采用RT-nPCR方法,其灵敏度在样品为皮肤组织切片时为每个样本98.3%,比样品为唾液(70.2%)和尿液(9.5%)时更高。当样本为唾液时的灵敏度是74.6%(67个样本),用唾液涂布的样本的灵敏度为52.9%(17个样本)。然而,通过对被狂犬病毒感染患者唾液的3份系列样本进行检测,100%的患者都可确诊。在症状出现的头两天,唾液中的病毒阳性率会升高,直到第7天甚至更久,阳性率依然保持稳定。在其它的一些报告中,唾液样本比脑脊髓液(CSF)样本的阳性率更高。

  1998-2009年间,在泰国的朱拉隆功(Chulalongkorn)大学医院,我们使用NASBA试验对56名病人进行调查,结果已经整理归纳在表1(兴奋型狂犬病人)和表2(麻痹型狂犬病人)中。唾液检验的灵敏度(62个样本中47个为阳性,灵敏度为75.8%)比提取的毛囊(26个样本中13个为阳性,灵敏度为50.0%)、脑脊髓液(30个样本中13个为阳性,灵敏度为43.3%)和尿液(41个样本中16个为阳性,灵敏度为39.0%)检测的灵敏度都更高。但是,因为缺乏RNA提取对照,这些结果并不能区分假阴性和真阴性。在生前诊断中,有7名病人的结果为阴性。使用NASBA(表1中的第6、34、42号病人,表2中的P2、P3)、DFA和RT-PCR(表1中第46号病人、表2中P6)对这些病人的脑组织进行了再次检查,发现3名假阴性结果的患者(表2中P2、P3、P6)实际上为麻痹型狂犬病人。所有的唾液样本均在连续两天之内完成收集和检测。此外,病人P2的脑脊髓液和尿液的检测在同一天内、同一条件下完成,病人P3的尿液检测在前后两天中完成,病人P6的脑脊髓液、尿液和提取毛囊的检测在同一时间、同一条件下完成。目前还无法判断麻痹型狂犬病人的神经组织受损是否会对实验结果产生影响。其余四名假阳性结果的病人实际上患的是兴奋型狂犬病。有三名病人(表1中第6、43、46号病人)只分析了一个样本。第34号病人在症状出现后两天开始收集唾液、尿液和毛囊,其检测结果为阴性。他被一只患狂犬病的狗咬到了鼻子,十九天后开始恐水性抽筋,发作后三天便死亡。这个例子表明,无论有多少样本的早期诊断结果为阴性,在随后的数天里进行重复检测和进行动物尸检仍然很重要。总而言之,推荐用于人类生前狂犬病检测的样本为皮肤、唾液、脑脊髓液和尿液。

  样本处理

  由于样本的收集和保存质量不高,使用NATs检测狂犬病毒RNA的结果可能不佳。除了与所使用的技术和所设计的目的基因有关外,检测的结果和灵敏度还与临床症状各个阶段的样本收集时机和样本类型相关。取自疑似狂犬病人的所有样本都要小心操作,防止感染。样本容器必须封口严实。必须在无菌环境下、使用无菌操作取用样本。在收集样本后,应在24h内置于冰上,转送至实验室。否则,应当存储在-20°C或更低温度下,并用干冰冷冻。

  核酸纯化

  核酸提取的质量对核酸检测而言是非常关键的。核酸需要纯化,并确定没有抑制剂的存在,应该储存在-70℃或者更低的温度下,还要避免反复冻融。样本制备的实验区域应该和核酸扩增区域和扩增后区域分开,以避免交叉污染。在所有的核酸提取步骤中要使用含有安全滤芯的移液管枪头,因为低至20ng的污染物就能引起假阳性反应。在所有的提取和扩增步骤中,应该设置一个已知的狂犬病毒阴性对照样本。

  为了提高效率,有时需要进行提取前处理,比如制备组织样本的均浆、滤纸或毛囊中样本的洗脱、蛋白酶K消化经福尔马林固定和石蜡包埋处理的组织,以及皮肤活体检查组织样本。为了提高检测的灵敏度,在提取程序中需要获取大量的核酸,这可以通过增加生物体液的体积或者组织样本的数量来实现。使用基于二氧化硅-异硫氰酸胍或者超灵敏型病毒DNA/RNA提取试剂盒的Boom技术(NucliSens Isolation Kit),允许处理高达1-2ml的生物液体。

  市场上有许多有效的方法可以用于生物样本内全RNA或mRNA的分离。用TRIzolR(一种商用试剂盒)提取RNA,是纯化狂犬病毒全RNA的最常用方法。TRIzol试剂盒是一种含有苯酚和异硫氰酸胍的单相溶液。首先将细胞或者组织在TRIzol试剂中裂解,再向裂解物中加入氯仿,使溶液的水相和有机相分层。倒去水相后再用异丙醇沉淀RNA。该提取方法是基于含有二氧化硅膜(用于RNA的复原)的RNA结合层析柱,市场上已有许多相应的产品。应根据样本的类型、RNA和起始物质的数量来选择合适的柱。Qiagen RNeasy Lipid Tissue®试剂盒已经过优化,可用于脂肪组织,比如脑组织。该试剂盒优化整合了苯酚/胍的裂解和RNeasy纯化工艺,以分离高质量的无苯酚残留的总RNA。

  质量控制

  提取RNA时,设置内部对照(如管家基因rRNA 或者β-肌动蛋白mRNA)或者外部对照通常是有益的。同源或者异源的外部对照是不会在样本来源中自然产生的。同源对照含有与目标核酸的两侧核苷酸序列(为引物退火处)相同的序列,只是内部序列(为探针退火处)不同,而异源对照由分离的可扩增靶位组成。当进行基于RNA检测的分子试验时,若不设置这类对照,是无法排除假阳性结果的,因此设置这类对照是必须的。

  在狂犬病毒的大(L)聚合酶基因的TaqManRT-PCR试验或RT-nPCR试验中,β-肌动蛋白mRNA可以作为内部对照来评价病毒RNA模板的质量。在脑脊液样本中,因为目标序列大量存在,使用rRNA比β-肌动蛋白mRNA更加灵敏。在37℃下,360 h时间内,rRNA和取自小鼠脑组织的狂犬病毒RNA具有相同的降解动力学;β-肌动蛋白RNA则不同,其在4℃下保存,72 h后便降解。因此,rRNA可作为病毒目标序列完整性的对照。在同一实验中分别使用不同标记探针,同步扩增内部对照(18S rRNA)和澳大利亚蝙蝠狂犬病毒(ABLV)RNA已经能够实现。

  使用低拷贝数的RNA质粒(而不是rRNA)作为外部对照,能够监测较小的抑制作用。尿液和脑脊液等样本,可能含有极微量的细胞物质,这时,使用外部对照会比使用看家基因更有价值。

  核酸扩增

  扩增目标

  N基因是狂犬病毒中最保守和高表达的基因。它的序列研究得最透彻,是最常用的扩增目标序列,也常被作为实时PCR试验的靶标。对所有的狂犬病毒的基因型而言,N基因的5’和3’端编码区比内部序列更为保守。根据来自泰国的239例分子遗传流行病学数据,设计了N基因的引物和探针,用来评价和检测泰国及附近国家的狂犬病毒。最低的检测阈值是每20μl反应体系里4.0个拷贝。在巴西,使用多功能RT-PCR从不同宿主样本中分离狂犬病毒进行快速诊断和确诊时,除N基因以外,还可用糖蛋白(G)基因、G-L基因间区域和L基因等靶位设计引物。这种方法有效的最低检测量是每ml反应体系中含2ng RNA。皮肤活组织检查样本(体积20mm3)的狂犬病毒L基因序列上RT-hnPCR靶位的保守区域,显示了98.3%的灵敏度(59/60个样本),然而皮肤活组织检查样本(1cm2;n=10)的N基因RT-PCR靶位检测的灵敏度是70%。前者更高的灵敏度也许与扩增方法、目的基因和样本的大小、体积等不同有关。要弄清这些问题,需要在标准条件下对这两种基因的灵敏度进行更进一步的比较。

  引物设计

  作为诊断试验的RT-PCR,其效用取决于引物是否能够有效地扩增出狂犬病毒所有毒株或基因型。在一次试验中,由于反应体系中存在大量的目的RNA,即使18 bp引物和模板间有3 bp的碱基错配,仍然能够产生可检测到的PCR产物。目的基因和引物或探针序列之间的碱基错配会大大降低检测的灵敏度,甚至完全得不到检测结果。病毒目标序列和TaqMan引物(正向引物和反向引物分别为26和20个核苷酸)或探针(16个核苷酸)序列间4个以上的碱基错配会导致结果为弱阳性或阴性。在其它研究中,探针(31个核苷酸)和目的基因间3个碱基错配,会导致结合效率降低。探针结合区域的4个碱基错配会妨碍荧光信号的产生。降低扩增子的大小、使用空间位置更接近的引物、使用引物和简并引物的混合物,都可以提高扩增的效率。对于RNA完整性较低的样本,比如用福尔马林固定和石蜡包埋的组织,如果使用的引物能产生大小为139--150 bp的短扩增子,则肯定能成功地实现cDNA扩增。

  已经开发出用于检测部分或所有狂犬病毒的通用简并引物,在进行狂犬病监测时,这些引物可检测与普通狂犬病毒不同的狂犬病毒相关病毒。使用高度简并引物的不足之处是PCR退火温度须足够低,以确保引物和模板DNA的有效配对。然而,在不够严谨的条件下,产生非特异性PCR产物的可能性将提高。根据可代表全球普通狂犬病毒多样性的203个分离株资料,设计了三组用于实时PCR的引物和探针,并进行了评估。但是,这些引物和探针除了能够检测基因1型,还能检测基因5型和Khujand病毒。

  逆转录PCR

  由于狂犬病毒是RNA病毒,其扩增的过程包括将病毒RNA基因组或靶位病毒转录子逆转录成cDNA。随后再对cDNA进行PCR扩增。使用特异性的上游引物和/或随机引物,依据病毒RNA合成cDNA,此为逆转录过程。在逆转录过程中,使用正义(上游引物,5’引物)引物和反义引物(下游引物,3’引物)从mRNA和病毒RNA合成cDNA,之前已有报道。

  逆转录和PCR使用同一个缓冲体系,在该体系内,单一热循环程序不中断,形成单管RT-PCR,这样可以避免各操作步骤中的交叉污染。已经开发出其它的狂犬病一步法RT-PCR商用试剂盒。使用逆转录酶的阳性上游引物,一步实时PCR法比两步逆转录PCR法更灵敏。一步法可以检测RNA的正链和负链,而两步法只能检测负链。另一种方法是巢式PCR,其初始PCR的产物易受到第二轮扩增(使用第一轮扩增产物的内部引物)的影响。半巢式PCR使用的引物为第一轮扩增的一个引物和在第二轮扩增另一端的一个内部引物。病毒悬浮液中低至8pg的RNA,能够通过RT-nPCR检测到524bp的N基因PCR产物。RT-hnPCR法检测CVS-11狂犬病固定毒株的最低检测值是0.0016TCID50。RT-hnPCR比RT-PCR更加灵敏。在50份解冻的不同动物的脑组织样本中,RT-PCR检测的阳性率为52%(26例),RT-hnPCR检测的阳性率为90%(45例)。RT-hnPCR比MIT、RTCIT的灵敏度也更高。尽管这些再扩增方法的灵敏度是一步扩增方法的10-100倍,但是交叉污染的可能性却提高了。使用匹配良好的引物进行第一轮PCR,在大多数情况下,都可以避免进行巢式PCR。

  PCR产物的检测

  通常, 根据分子量大小,可通过琼脂糖凝胶电泳来分离PCR产物,再使用溴化乙锭(一种嵌入碱基间的染料)染色,在紫外光下便能够看到结果。比凝胶电泳观察更加灵敏且特异性更高的检测方法是扩增子与狂犬病毒特异性寡核苷酸或DNA探针进行杂交。为此可将产物转移到膜上,这便是Southern Blot杂交,或者采用基于ELISA的方法。Southern Blot杂交用于对埃塞俄比亚狼脑样本的RT-PCR产物的确认,该样本用DFA和MIT方法检测时均被认定为狂犬病阴性。RT-PCR和ELASA比Southern Blot杂交的灵敏度高100倍,能检测0.00002 TCID50/ml浓度的基因1型样本。扩增产物也可以通过限制酶分析或者核酸序列分析来确认。要确定狂犬病毒基因型,序列分析仍是最好的方法。

  实时PCR 

 实时PCR是基于荧光强度来检测和定量的,在单次反应中,荧光强度与PCR产物数量成正比。起始时目的核酸的拷贝数目越多,荧光强度显著增强的速度越快。荧光反应通常使用非特异性的化合物,比如DNA增补染料SYBR Green,或者携带供体和荧光淬灭基团的序列特异性寡核苷酸探针。这些技术与传统RT-PCR相比有诸多优势,比如检测时间快(2-4 h,而传统的RT-PCR和DNA序列测定需要12-20 h),由于封闭的试管系统(勿须进行扩增产物的第二轮PCR操作),因此能减少污染的风险,而且能够同时扩增和检测多种不同的目的基因。表3归纳了实时PCR检测狂犬病毒的几个关键点。

  已经研发了SYBR Green实时PCR,对蝙蝠器官内的欧洲蝙蝠狂犬病毒2型RNA负载进行定量。在脑中发现高水平的基因组RNA,在舌头、膀胱和胃中也同样可检测到。使用TaqMan实时PCR方法检测的狂犬病毒的数量,与MIT分离的病毒估计值明显相关。在某些病例中,该方法可以代替像MIT那样耗时的病毒滴定法。TaqMan 实时-PCR检测是评估兴奋型和麻痹型犬脑中病毒负载量的一种简单方法,因为在前者中和接受了治疗的狂犬病人生物样本中发现了更大量的病毒。

  在我们医院,曾使用催眠、利巴韦林和克他命等手段治疗一个兴奋型狂犬病病例。但是,在8天的住院治疗中,NASBA和基于TaqMan的定量检测结果,在所有测试的样本中并不完全一致(表4)。NASBA比TaqMan实时PCR的灵敏度更高。这与之前和RT-nPCR比较的结果是一致的。分别使用NASBA和基于TaqMan的定量方法,提取的毛囊样本检测结果的阳性率分别是8个样本中有3个(第1、3、4天)和6个样本中有1个(第1天)。在第一天使用NASBA检测唾液中的狂犬病毒RNA是阴性,而在第2-8天,使用两种方法的结果均为阳性。有一个类似的狂犬病患者,该患者使用Milwaukee方案治疗,可发现唾液中的狂犬病毒含量随时间的延长而减少;但与此相反的是,我们的病人所携带的病毒量从第一天的每ml样中43.3个拷贝上升到死亡时的每ml样本中432,000个拷贝。

  实时PCR 方法对人类生前狂犬病的诊断具有重大价值。使用一步法TaqMan实时PCR试验检测27个狂犬病疑似病例的狂犬病毒RNA,其中只有3名病人是狂犬病(从这3名病人所取的共8个样本中有7个是阳性的)。TaqMan试验也可以检测ABLV感染病人的唾液和颈部皮肤组织切片中的病毒。SYBR Green实时PCR可在人类唾液样本中进行狂犬病毒的生前检测。相比传统的PCR,实时PCR测定的灵敏度更高,而且使用简便,提示它们可能适用于狂犬病病例的常规诊断。

  TaqMan试验

  TaqMan试验是实时PCR试验中所使用的最常用的化学方法。它采用双标记的寡核苷酸探针,用荧光报告基团标记5’末端,用淬灭基团标记3末’端,这两部分非常靠近时,报告基团不能发出荧光信号。探针检测系统在特异性上优于常规的RT-PCR。在澳大利亚动物卫生实验室对超过100个样本进行的常规分析显示,探针检测系统的分析特异性高于RT-PCR。

  快速TapMan实时PCR 方法能同时检测和区别不同狂犬病毒的基因型或生物型。设计出8种不同的探针(包括3种基因1型特异性探针,和基因2-6型各一种探针),以区别基因1-6型狂犬病毒。在另一份文献中,设计了用不同荧光报告基团标记的3种不同探针,用于区别同一个反应管中的基因1、5和6型。来自狐蝠和食虫蝙蝠的ABLV的两种生物型能被检测到,并能被两套独特的TaqMan引物和探针所区别。

  实时PCR检测,不管是用TaqMan还是SYBR Green 试剂盒,其灵敏度与传统的RT-PCR或巢式PCR相当甚至更高。在对浣熊狂犬病毒标准株进行的实验中,基于TaqMan的检测比传统的RT-nPCR灵敏度高1000倍。一步法TaqMan RT-PCR比RT-hnPCR的灵敏度高10倍,狂犬病毒检测的最低值分别是是0.1和10 TCID50/ml。半巢式PCR比使用cDNA作为模板的初始TaqMan实时PCR灵敏度更高。但是,以初始PCR扩增子用作TaqMan实时PCR的模板时,两者的灵敏度相当。

  SYBR Green试剂盒方法

  基于SYBR Green实时PCR的产物可通过DNA-增补染料(SYBR Green)来检测,能在一个反应中检测所有双链DNA产物。在扩增完成时,使用非特异性荧光染色分析溶解(变性)曲线,可确认PCR产物。当探针-目的基因结合位点的可变性增加时,SYBR Green检测更适用。SYBR Green实时PCR试验作为人类的生前诊断已经有报道,检测唾液的灵敏度为87.5%(21/24名病人)。其敏感性高于传统的巢式PCR(75% 对 37%)。SYBR Green实时PCR试验具有检测来自活的狂犬病疑似狗样本中的狂犬病毒的潜力。在该研究中,使用SYBR Green 试剂盒,以初始PCR产物作为模板,15只狗中有13只(87%)的唾液检测为阳性,4只的脑脊髓液检测结果为阳性。但是,生前样本检测的阴性结果不足以排除狂犬病的可能性,因为这些人类和动物样本会间歇性排毒。

  等温扩增

  基于核酸序列的扩增

  与PCR不同的核酸扩增试验方法的开发是为了达到诊断的目的。NASBA是酶在等温条件下进行的扩增过程。扩增反应涉及到的三种酶是禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶、大肠杆菌的核糖核酸酶H和T7 RNA 聚合酶。每一种酶在扩增有义链和反义链的目的RNA过程中,持续作用于其对应的底物。反应的特异性由针对目的RNA的两种寡核苷酸引物决定。其中一个引物5’末端为T7 RNA聚合酶启动子序列(引物1),并连接一段与目的RNA序列互补的核苷酸序列。另一个引物(引物2)含有一段与目的序列片段相同的短序列,并位于T7启动子包含的寡核苷酸序列退火区域的上游。NASBA反应在等温条件下能够自发维持,因此能够在短时间内大量扩增。在90分钟内能够扩增106到109倍。NASBA的产物是单链RNA,勿须变性即可进行探针杂交检测。如果引物2的非相关序列被报告探针所识别,可使用电化学发光阅读仪,通过化学发光探针对RNA产物进行特异性检测。这种方法比RT-nPCR敏感度高100倍,且整个过程,包括自动提取、等温扩增及检测等,可以在4h内完成。NASBA已经用于检测狂犬病人的唾液、脑脊髓液和尿液中的狂犬病毒RNA。最近发展了一种实时NASBA技术,但这一技术还没有应用到狂犬病毒的检测当中。

  RT-环介导等温扩增

  环介导等温扩增(LAMP)是一步扩增反应,通过其高度敏感性和特异性可在等温条件下扩增目的DNA序列。其原理是基于Bst聚合酶作用下的链的置换和由4种特异性引物形成的茎环结构,该引物在恒定温度(约65℃)能够识别目的DNA的6个独特区域。LAMP的扩增效率很高,在15到60分钟内能够将DNA扩增109到1010倍。由于此种方法的高度特异性,有扩增产物出现便可证明目的基因的存在。已经开发了用于检测狂犬病毒的一步RT-LAMP法,使用5个特异性引物,包括两个外部引物、一个环状引物和两个内部引物。它可以检测103拷贝数的合成病毒RNA,并且比传统的RT-PCR的敏感性高10到100倍。RT-LAMP产物的特异性可以使用RsaI限制酶来确认。针对CVS-11固定毒株而设计的一套引物无法扩增来自菲律宾的狂犬病毒。在引物对和目标序列之间共发现了24个核苷酸的差异。用RT-LAMP对广泛分布的狂犬病毒进行检测的障碍在于,需要设计一套引物,能够扩增来自不同地区的多种狂犬病毒毒株,这就要求其中的若干种引物能夠以6个不同区域为靶标。

  微阵列(芯片)分析

  基于微阵列芯片分析的再测序技术在细菌和病毒性病原体的检测、鉴定方面前景看好。在存在背景DNA的情况下,它可以从各种脑炎病原体的混合物中检测出狂犬病毒的基因组。在采用微阵列再测序步骤之前,全转录组扩增(WTA)——改进的全基因组扩增,可用于整个RNA病毒基因组的cDNA扩增。基于这一技术,水泡性病毒属和狂犬病毒属——它们属于系统分类上不同的属,检测的效率分别是96.8%和73.6%。真核核酸的存在并不妨碍WTA扩增,也不会妨碍下游的DNA微阵列上的病原体鉴定。WTA与常规RT-PCR相比,具有更好的检测敏感度和精确性。基于DNA微阵列的方法能够同时检测和鉴定所有7种狂犬病毒的基因型,包括Aravan、Khujand、Irkut和West Caucasian蝙蝠病毒,而且已开发了能够鉴定新的不同分离株的微阵列。狂犬病毒RNA逆转录成cDNA,以随机PCR方式进行扩增,标记并与微阵列芯片上的探针杂交,然后进行统计分析。通过使用含有624个 70-mer探针微阵列的狂犬病毒/致病病毒芯片,能准确鉴定和区分7种狂犬病毒的基因型。探针以相关的保守的N基因中一个405bp的区域(核苷酸71-475)为靶标。这种检测狂犬病毒的新的分子工具,超出了大多数位于亚洲和非洲狂犬病毒流行国家的实验室的能力,可能目前还不适于用作为诊断狂犬病的方法。

  专家评论

  对疑似狂犬病患者的适当处置的前提是快速而准确的诊断。合适的生前诊断方法应该高度敏感,能够检测到生物样本中早期的低载量的狂犬病毒RNA。NAT(s)可在数小时之内完成操作,因此可能满足这个要求。在生前或死后的实验诊断中,NAT(S)被用作其他检测的补充,甚至作为唯一的检测手段。该病毒可能在生物液体、脑以外的外围神经和组织中间歇性地排出或极微量地存在。因此,不推荐将NAT作为动物狂犬病毒的主要诊断工具。可能会影响病毒RNA的数量和质量的因素是狂犬病毒感染的阶段、用于检测的样本类型或者对样本的处理是否适当。可用RNA提取控制系统来控制RNA的完整性,避免每一个单独试管中假阴性结果的出现。假阴性结果的出现是由于操作失误、酶抑制剂的存在或者病毒RNA的降解。病毒RNA的质量和数量能够影响引物结合和扩增的效率。直接对比文献报导过的各种RT-PCR、RT-n PCR、RT- hn PCR及实时PCR等狂犬病毒检测方法的敏感度是困难的,因为分别采用了不同的参考标准。将来对这些方法的对比应当采用同样的可靠对照,这样才能有助于这一技术的标准化,尤其在涉及到定量时。NAT的主要缺陷是样本中可能出现的交叉感染,尤其在巢式PCR中。必须采取标准化的预防措施,以避免所有NAT过程中的微量污染。应该对常规PCR的阳性产物进行测序,以确认病毒的来源,并排除污染的可能。这种验证步骤要定期进行,而且要批量使用当地的代表性病毒毒株,不一定是实验室中使用的病毒株。实验室之间的合作和试验的标准化将使人们对全球狂犬病的流行病学有更好的了解。

  五年的回顾

  五年前,基于核酸扩增的狂犬病毒分子诊断,主要关注及时和灵敏的人类生前诊断方法的开发。最近的实时PCR技术提供了更敏感的结果,并且能够减少诊断所需的时间。为了检测世界范围内多种多样的狂犬病毒,也研发了更通用的成套引物,其中某些可以区分狂犬病毒不同的基因型。若干生物样本,比如带有毛囊的皮肤切片、抽提的毛囊以及尿液,可以作为狂犬病毒RNA检测的替代样本。联合采用不依赖于序列的扩增方法和微阵列技术,能在生物样本中对狂犬病毒在基因型水平同时进行检测和鉴别。这将形成诊断生物芯片的基础。在将来,各种新技术,包括超微圆粒、微液滴和纳米微阵列技术,与常规的玻璃微阵列平台相比,可能在敏感度和处理速度方面都更有优势。对NATs的研发和评估应该能够促进人们对狂犬病问题及其对公众的威胁有更充分的认识。

  [Expert Rev. Mol. Diagn. 2010,10 (2):207-218  姜礼朋 季雅琦译 严家新校]


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