HPLC-MS分析细胞/血液提取物时基线漂移的原因探析（讨论版）

1  在通常情况下，RP-HPLC主要基于样品中不同组分的极性差异进行分离，一般用于非极性或弱极性化合物的分离，但这种解释不适用于分子量较高的物质分离（如蛋白质样品等,但不包括蛋白质酶解后的多肽样品）。

2  普通C18色谱柱的填料尺寸是~5mm，孔径是150埃，是市场上最常见、使用最为广泛的色谱柱。但是普通C18柱一般不用于分离蛋白质样品，原因是蛋白质容易造成柱阻塞，这也是使用普通色谱柱分离蛋白质样品后柱压升高的主要原因之一；分离蛋白或高分子量多肽样品一般使用填料尺寸是~5mm，孔径是300埃色谱柱。

3  因此，对于低分子量组分RP-HPLC主要基于不同组分极性的差异进行分离，而普通C18色谱柱分离分子量较高的组分时，分子筛效应会影响其在色谱柱中的保留行为，而不仅是基于不同组分的极性差异。当分子尺寸超过“某一范围”时在整体上出现这样的结果：分子量相同的物质极性越小保留时间越长，极性相同的物质分子量越大其保留时间越长。分子筛效应与目标物的分子量、形状有关。所说的“某一范围”并不好界定，对于高聚物和蛋白，这个“某一范围”肯定有区别。

4  对于从血浆中萃取出的样品或微生物/细胞浸提后的溶液，待分析的目标物可能是分子量较低的物质，但是萃取过程肯定会将部分多肽、脂类或微生物代谢产物等分子量较高的物质与目标物同时提取出，N2气吹干只是起到了浓缩或便于后续定容等效果，但多肽或脂类仍然留在样品中。导致HPLC/MS分析过程中，目标物被顺利洗脱出，但随后其它高分子量杂质也逐渐被洗脱出且杂质的分子量随保留时间延长逐渐上升，导致基线逐渐向上飘移。

5  所以，yf197854提出的问题原因之一是有许多其它杂质被萃取出，改变萃取条件使杂质等尽量地少浸提出可能会降低基线漂移，或优化色谱条件使得杂质尽量晚出来，这方面aa_tang先生的帖子中已经总结的很好、很全面，这里不再重复了。另一方面是象Hongyi先生提出的改变质谱监测模式－调整扫描范围或离子扫描方式，使质谱不检测超出设定分子量范围的杂质，基线就不会漂移特别严重，得到的总离子流图相对比较漂亮。

6 对于天然产物提取物、中药中的动物药等任何含有蛋白质和高分子量多肽的样品，上述情况也较为常见。

欢迎大家一起讨论上述内容，同时也帮助yf197854同志解决一个实际问题。