蛋白质分离纯化一条街:凝胶过滤层析
凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography,GFC)又称
尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography,SEC)
凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography,GPC)
分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography,MSC)
注:在高效液相色谱分析中,用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱,流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中,常用GPC表示凝胶渗透色谱,流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离,因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。
(1)分离机理
GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒,利用球状凝胶内的筛孔的大小,不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异,利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时,大分子无法进入凝胶筛孔,而只流经凝胶及管柱间的孔隙,因此总体运行路径较短,从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔,总体运行路径较长,故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子,亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异,因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
(2)应用范围
A 蛋白质分离,基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;
B 分子量测定,蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系;
C 样品脱盐或溶剂置换。
(3)填料要求
一般状况下,用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份,所有欲分离物质均被洗脱出,这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。凝胶的材质需为化学惰性,与分离物不能产生变性(denature)或是其它化学反应,最好具有能长期反复使用的稳定性,并可以在较大的pH和温度范围内使用。凝胶要有一定的机械强度,在层析过程中才不会变形,增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行,缩短分离时间。
(4)凝胶过滤常用填料种类
目前常用的凝胶包括3个主要类型:
A:葡聚糖凝胶(Polydextran),商品名称是Sephadex
Polydextran几乎不溶于溶剂中,亲水性强,能迅速在水和电解质溶液中膨胀,在碱性的环境中十分稳定,所以可以用碱去除凝胶上的污染物。
Sephadex G-X,X表示葡聚糖的交联程度,数值越大则交联度越小,但吸水量越高,X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25为例,表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。
Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关,大概范围如下:
型号 粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)
G 10 55-166 <700
G 15 60-180 <1500
G 25 - 1000-5000
G 50 - 1500-30000
G 75 - 3000-80000
G 100 - 4000-150000
G 150 - 5000-300000
G 200 - 5000-600000
Superdex属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶,流速快、反压低。
型号 粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)
Superdex 30 24-44 <10000
Superdex 75 24-44 3000-70000
Superdex 200 10000-600000
B 聚丙稀酰胺凝胶(Polyacrylamide)
Polyacrylamide是一种合成凝胶,商品名Bio-Gel P,干粉颗粒状。依胶的分离范围不同,分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300,P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼,但它在极端的pH下会被水解,水解后产生的COOH-具有离子交换的性质,因此pH 值应尽量控制在2-10之间。
型号 粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)
Bio-Gel P-2 - <1800
Bio-Gel P-4 - 800-4000
Bio-Gel P-6 - 1000-6000
Bio-Gel P-10 - 1500-20000
Bio-Gel P-30 - 2500-40000
Bio-Gel P-60 - 3000-60000
C 琼脂糖凝胶
商品名称Sepharose,由属于天然凝胶,依凝胶中干胶的百分含量,分为Sepharose 2B,4B和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶,主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质,因其颗粒软,在分离过程有时会阻塞管柱,造成流速减慢,又因其在摄氏50度以上会融化,故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥,所以要在湿态中保存。
经2,3-二溴丙醇反应交联而成的凝胶为Sepharose CL型凝胶
型号 粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)
Sepharose 2B 70000-40000000
Sepharose 4B 60000-20000000
Sepharose 6B 10000-4000000
Sepharose CL-2B 70000-40000000
Sepharose CL-4B 60000-20000000
Sepharose CL-6B 10000-4000000
Superpose 琼脂糖经多次交联形成的凝胶。
型号 粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)
Superose 6 5000-5000000
Superose 12 1000-300000
其它凝胶:聚丙稀酰胺葡聚糖凝胶,交联聚苯乙烯凝胶,聚乙烯醇凝胶等,还有更多新型号的凝胶。
4 操作实例(转载)
1) 凝胶溶胀
凝胶颗粒要求大小比较均匀 ,可流速稳定,结果较好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉,加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同),或沸水浴中溶胀3小时,这样可大大缩短溶胀时间,而且可以杀死细菌和霉菌,并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒,最后凝胶经减压抽气除去气泡,即可准备装柱。