蛋白质分离纯化一条街:part A-凝胶过滤层析

上一篇 / 下一篇  2009-03-21 20:34:23

蛋白分离纯化一条街:凝胶过滤层析

 

凝胶过滤层析(Gel Filtration ChromatographyGFC)又称

尺寸排阻层析(Size Exclusion ChromatographySEC

凝胶渗透层析(Gel Permeation ChromatographyGPC

分子筛层析(Molecular Sieve ChromatographyMSC

 

注:在高效液相色谱分析中,用GFCSEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱,流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中,常用GPC表示凝胶渗透色谱,流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFCSEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离,因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。

 

1)分离机理

GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒,利用球状凝胶内的筛孔的大小,不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异,利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。

蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时,大分子无法进入凝胶筛孔,而只流经凝胶及管柱间的孔隙,因此总体运行路径较短,从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔,总体运行路径较长,故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子,亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。

1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异,因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。

 

 

 

 

 

2应用范围

A 蛋白质分离,基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;

B 分子量测定,蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系;

C 样品脱盐或溶剂置换。

 

3)填料要求

一般状况下,用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份,所有欲分离物质均被洗脱出,这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。凝胶的材质需为化学惰性,与分离物不能产生变性(denature)或是其它化学反应,最好具有能长期反复使用的稳定性,并可以在较大的pH和温度范围内使用。凝胶要有一定的机械强度,在层析过程中才不会变形,增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行,缩短分离时间。

 

4)凝胶过滤常用填料种类

目前常用的凝胶包括3个主要类型:

A:葡聚糖凝胶(Polydextran),商品名称是Sephadex

Polydextran几乎不溶于溶剂中,亲水性强,能迅速在水和电解质溶液中膨胀,在碱性的环境中十分稳定,所以可以用碱去除凝胶上的污染物。

Sephadex G-XX表示葡聚糖的交联程度,数值越大则交联度越小,但吸水量越高,X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25为例,表示1干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml

Sephadex的分离范围与填料粒经和交联度密切相关,大概范围如下:

型号   粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)

G 10   55166      <700

G 15   60-180       <1500

G 25   -            1000-5000

G 50   -            1500-30000

G 75   -            3000-80000

G 100  -            4000-150000

G 150  -            5000-300000

G 200  -            5000-600000

 

Superdex属于葡聚糖以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的球形凝胶,流速快、反压低。

型号      粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)

Superdex 30  24-44        <10000

Superdex 75  24-44        3000-70000

Superdex 200              10000-600000

 

聚丙稀酰胺凝胶(Polyacrylamide

Polyacrylamide是一种合成凝胶,商品名Bio-Gel P,干粉颗粒状。依胶的分离范围不同,分成Bio-Gel P-2Bio-Gel P-300P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼,但它在极端的pH下会被水解,水解后产生的COOH-具有离子交换的性质,因此pH 值应尽量控制在2-10之间。

型号            粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)

Bio-Gel P-2        -      <1800

Bio-Gel P-4        -      800-4000

Bio-Gel P-6        -      1000-6000

Bio-Gel P-10       -      1500-20000

Bio-Gel P-30       -      2500-40000

Bio-Gel P-60       -      3000-60000

 

琼脂糖凝胶

商品名称Sepharose,由属于天然凝胶,依凝胶中干胶的百分含量,分为Sepharose 2B4B6BAgarose gel 是一种大孔凝胶,主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质,因其颗粒软,在分离过程有时会阻塞管柱,造成流速减慢,又因其在摄氏50度以上会融化,故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥,所以要在湿态中保存。

23-二溴丙醇反应交联而成的凝胶为Sepharose CL型凝胶

型号                     粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)

Sepharose 2B                7000040000000

Sepharose 4B                6000020000000

Sepharose 6B                100004000000

Sepharose CL-2B             7000040000000

Sepharose CL-4B             6000020000000

Sepharose CL-6B             100004000000

 

Superpose 琼脂糖经多次交联形成的凝胶。

型号            粒度(微米) 有效分离范围(球形蛋白质)

Superose 6          50005000000

Superose 12          1000300000

 

其它凝胶:聚丙稀酰胺葡聚糖凝胶,交联聚苯乙烯凝胶,聚乙烯醇凝胶等,还有更多新型号的凝胶。

 

操作实例(转载)

1) 凝胶溶胀

凝胶颗粒要求大小比较均匀 ,可流速稳定,结果较好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉,加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天(溶胀时间因凝胶交联度不同而不同),或沸水浴中溶胀3小时,这样可大大缩短溶胀时间,而且可以杀死细菌和霉菌,并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒,最后凝胶经减压抽气除去气泡,即可准备装柱。 


TAG:

分析测试 引用 删除 yq2009   /   2009-09-24 14:17:38
好东西大家一起分享。
分析测试 引用 删除 yq2009   /   2009-09-24 14:17:07
进来学习一下。
原子荧光 引用 删除 F20090330   /   2009-04-01 22:25:48
非常不错的文章啊,谢谢楼主分享。值得好好看看。
仪器分析 引用 删除 yty6699   /   2009-03-27 11:55:13
太珍贵的资料了。
aa_tang的个人空间 引用 删除 aa_tang   /   2009-03-26 20:16:40
谢谢,学习学习

PURIFICATION  PROTOCOLS

http://wolfson.huji.ac.il/purification/Purification_Protocols.html
nemo 引用 删除 nemo   /   2009-03-24 10:53:34
图文并茂,楼主真是费心了。这一行的好多文章如果没有图片,就不能成为是好文章啊
hplcangel 引用 删除 hplcangel   /   2009-03-22 15:41:46
真的是很好的资料,收藏了。
PURPOSE人生 引用 删除 PURPOSE人生   /   2009-03-22 13:35:53
资料很好,值得好好看一下。
owoo 引用 删除 owoo   /   2009-03-22 08:40:49
这篇资料对蛋白质分离纯化介绍得很详细,值得收藏感谢分享。
gitde 引用 删除 gitde   /   2009-03-21 21:54:10
很不错的资料,谢楼主的分享。
 

评分:0

我来说两句

显示全部

:loveliness::handshake:victory::funk::time::kiss::call::hug::lol:'(:Q:L;P:$:P:o:@:D:(:)

日历

« 2024-03-29  
     12
3456789
10111213141516
17181920212223
24252627282930
31      

数据统计

  • 访问量: 14919
  • 日志数: 52
  • 建立时间: 2008-07-22
  • 更新时间: 2012-10-15

RSS订阅

Open Toolbar