纸上谈药，一个畅销药的奋斗史（3-）——No drug is good drug ！

　　Robert F. Furchgott

　　引子：记得小时看武侠片，一般绝顶高手都会解码武功的最高境界——“无招胜有招”。其实最好的用药方式就是不用药。不过我们今天要谈到的“NO Drug”并不是不用药，而是一个传奇的分子——一氧化氮。 的确有不少畅销药就跟它有关。今年一月份，美国匹兹堡大学的陈丰原教授来实验室访问，有幸一起陪同吃饭。他是一氧化氮和心血管方面的专家，席间跟我们讲起了NO发现那段惊心动魄的故事，当天晚上我很想把这段故事记录下来，无奈水平有限，他说的一些外国人的名字我都拼不来没法动笔，只好重新慢慢收集资料做些功课，中间经过一个春节杂事很多也一直没下决心写。今天想起他讲的故事，开始第三次“纸上谈药”的历程吧。因为是故事，所以会有些“艺术加工”，虽然不是 “纯属虚构”，但是“如有雷同，纯属巧合，敬请见谅”吧!

　　在正式开始故事之前，有必要提一下诺贝尔，这段且称为“NO前传”吧。

　　1898年12月，Alfred Bernhard Nobel 去世前不到两个月的一天，他给他的一位同事留言：“医生给我开的药竟然是硝酸甘油，难道这不是对我一生巨大的讽刺吗?”言外之意，医生居然给我吃炸药?!没错，Nobel发明了炸药，硝酸甘油就是其中的主要成分。不过在他之前还有其他的贡献者。1867年，Brunton发现亚硝酸戊脂的物质，可以缓解心绞痛，同时可以降低血压;1846年，意大利化学家Sobrebro发明了硝酸甘油，但这是一种极不稳定的能够引起爆炸的液体;1867年，诺贝尔发明了安全使用硝酸甘油的方法，他将硝酸甘油同二氧化硅混合在一起，这样液态的硝酸甘油就变成了半固体状硝酸甘油炸药;1879年，英国伦敦 Westminister医院的William Murrell提出将硝酸甘油稀释后就可以转变成一种无爆炸性的物质，该物质可以作为心绞痛的药物。硝酸甘油随即成为一线药物，畅销世界，直到今天还是。尽管当初人们并不清楚其中的机理，但是丝毫不妨碍它的使用。就在诺贝尔去世的100年之后，即1998年，诺贝尔奖授予了揭开这个谜团的工作。冥冥中，经过一个轮回!

　　我们故事的主人公就是获得1998年诺贝尔奖的三位科学家。现在有请男一号，Robert Francis Furchgott 。Furchgott 生于1916年，1937年在在北卡大学修完化学，然后于1940年在西北大学获得生物化学博士学位。有时真是感慨没生在那个年代，拿个博士学位好像不用花太长时间，不像现在至少都是5、6年。在华盛顿大学呆了几年之后，逐渐有了点名气，随后去了纽约州立大学downstate分校医学中心做了药理教授。这也是他一生中工作时间最长的一个地方。直到2009年去世。他的工作单位在一个黑人聚居区，很偏僻，治安和环境都不是太好，在今天看来这绝对不是一个好的选择。相比今天大学生倾向去的“北上广”，那里大概相当于我们的二三线小城市，而且是经济不算很发达的。那个时候，各种内源性的化学物质相继发现，乙酰胆碱、肾上腺素、组胺等等。Furchgott 把主要精力放在了，研究这些物质对血管平滑肌的作用，也就是今天的体外药理实验。实验装置也很简单，把新西兰大白兔的主动脉取出来，剪成螺旋状的血管条，一头固定，另一头连着一台张力换能器，血管条泡在恒温的水浴槽中，然后往水浴槽里添加各种药物，观察血管的收缩反应。Furchgott每天就干这个事，乐此不疲，而且一干就是几十年，逐渐成了这个圈内的“权威”。

　　早在1953年，那时Furchgott还没有去后来的单位，他发表了首篇乙酰胆碱和组胺致兔离体血管条收缩的论文，然而整体动物静脉注射乙酰胆碱或者组胺却引发了血管舒张的效应。Furchgott坚持自己的实验重复性很好，而且观察无误。1955年，Furchgott在一篇综述中提出假说——血管平滑肌上也有两种胆碱能受体，跟肾上腺素的alpha和beta受体一样。尽管后来，有别的实验室发现了乙酰胆碱对离体血管的舒张作用，不过碍于 Furchgott的权威，再加上乙酰胆碱对非血管平滑肌的作用是收缩效应，几乎所有的人都没有深究。

　　解铃还须系铃人。直到1978年一次偶然事故，谜团终于被Furchgott自己撕开。那天是个值得纪念的日子，5月5日。早晨一到实验室，Furchgott照例给助手David布置了实验任务，然后匆匆忙忙出了门。David那天可能是跟女朋友闹分手，女朋友一个劲劝他离开这个鬼地方，David心情不是很好，做实验时也心不在焉，不过教授布置的任务还得继续。下午，教授回来了，他给教授汇报结果。这次结果很奇怪，不应该这样啊?于是，Furchgott领着他重新核查实验细节，David显得有些慌张。很快，教授发现了问题所在，不过并没有责怪他，只是叫他明天按照今天的步骤重复一遍，严格的重复一遍，他点点头。

　　具体说来，Furchgott给助手David布置的任务是这样的。如图1。把血管条挂上实验装置后，先加入apha受体阻断剂，这样血管平滑肌上的 alpha受体就被阻断剂封闭了。然后加入乙酰胆碱使得血管有一个预收缩的过程。跟着加入肾上腺素，血管平滑肌就开始舒张，这是因为肾上腺素对血管平滑肌上的alpha和beta受体都能激动，如果事先封闭了alpha受体，那么肾上腺素只能激动beta受体，表现出的就是舒张效应。也就是说血管平滑肌上 beta受体介导舒张。

　　Furchgott在核查实验细节时，发现了David的两个失误。一个是David处理血管条标本时，并没有把主动脉剪成以往的螺旋状，而是直接挂在装置上;二是，David加药时弄错了，他忘了加入alpha受体阻断药，而且把肾上腺素和乙酰胆碱的加入顺序搞反了，更糟糕的是加乙酰胆碱时，肾上腺素并没有洗掉。这样出现的结果就是，肾上腺素使得血管收缩，而后加入乙酰胆碱，血管开始舒张!奇怪了!

　　

　　图1

　　一连三天，David做出的结果都是一样的。Furchgott很纠结，会不会是两种获取标本方式对血管有什么不同的影响?他让助手拿不同的两份标本去做组织学检测。经过一段时间努力，结果出来了，血管平滑肌的衬里——血管内皮有区别。螺旋式的血管条标本几乎见不到完整的内皮细胞，而血管环状的标本内皮细胞没有损伤。难道跟内皮细胞有关?Furchgott发现导致螺旋状血管条标本内皮损伤的原因可能跟操作过程中反复的摩擦有关。

　　经过大脑飞速的运转，一个绝妙的试验计划在Furchgott的脑中形成。很快实验就做完了，结果很漂亮。

　　具体说来，这个实验是这样的：

　　一是实验设想，内皮细胞有无是舒张效应的关键吗?为什么刺激内皮细胞可以引起血管平滑肌舒张?会不会是内皮细胞受刺激后释放某种物质扩散到平滑肌并导致其舒张?

　　二是实验设计，分为四步。第一，正常的血管环标本摩擦前后的比较;第二，正常血管环用胶原酶处理前后的比较，看化学损伤;第三，如图2，三个血管环标本，1号去除内皮，2号含内皮，3号是把前两个并排挂在一起，且内膜相对。这也是后来被广泛称道的“三明治血管灌流模型”。结果1号，没有舒张，因为没有内皮;2号，有舒张，因为内皮完整;3号也有舒张，说明内皮完整的那个血管条受刺激后释放了某个东西使得临近的血管也舒张。

　　第四步实验，Furchgott还观察了缺氧和有氧情况下血管条的反应，发现缺氧时，即便内皮完整，血管条也不舒张。多年之后，人们终于证明内皮细胞释放的就是NO，而NO生成需要氧气时，不得不感慨Furchgott当年实验的精妙，竟然如此“鬼斧神工”!

　　

　　图2

　　拿到实验结论的Furchgott很激动，他决定把这个结果投到《Nature》。

　　题目是：“The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine”.内皮细胞是乙酰胆碱诱导动脉平滑肌舒张的必要因素。

　　Furchgott是一个很老实很本分的人，他一辈子也没玩什么先进的科研技术，要知道当时的分子生物学、转基因等等可是热火朝天啊。而他老人家几十年如一日的摆弄着“离体血管灌流装置”，虽然有些成就，可是激动人心的进展并不多。原本想着再干个几年就可以退休了。现在，他感到这些结果里面蕴含着惊天动地的秘密。所以，他终于决定试一试这个他以前都不曾想过的杂志。那时，投稿基本还是邮寄，Email还没有来得及普及。几周过去了，Furchgott 盼来了一封退稿信，两个审稿人的意见都是不予刊出，因为他提出的内皮细胞释放了某东西并不知道是什么玩意儿，太玄乎了。如果按照以前，退了就退了，老实的他不会多做争辩，换个杂志就是。可这一次，他再也忍不住了。他给编辑部写了一封信，请求编辑再另选一个审稿人。这一次他遇到知音，第三个审稿人正好也是做血管的，他看到Furchgott的结果很兴奋，随即通知编辑部接受了这篇稿子。

　　这时，那个内皮释放的东西还没有名字，正式有名字了是来源于一篇1982年PNAS的文章。在这篇工作里，Furchgott发现一种叫缓激肽的物质跟乙酰胆碱的作用类似，内皮释放的导致平滑肌舒张的那个玩意还是照例来了。Furchgott给这个蒙面者取了个名字叫“endothelium- derived relaxing factor”，即EDRF。

　　随后，EDRF的研究、血管内皮的研究开始风靡全球。EDRF的真实身份是什么呢?Furchgott很纠结也很兴奋，他孜孜不倦的工作着，虽然进展不多始终未能窥得EDRF的庐山真面目，不过根据蛛丝马迹，他猜测这是小分子的脂溶性很好的物质，根据硝酸甘油类的药物提示，有可能是NO。答案很快就会知道!

　　1986年夏季，美国实验生物学会在明尼苏达州的Rochester举行了一次研讨会，第一个报告人是Furchgott，他汇报了自己的工作进展，最后他说EDRF有可能是NO。第二个上台的是Louis J. Ignarro，他赞同Furchgott的观点，也认为EDRF是NO，并且拿出了一些侧面证据，比如含硝基的药物和乙酰胆碱诱导的EDRF都能使血管平滑肌中的一种叫cGMP的物质升高而不是cAMP，并且都出现血管舒张反应。此前cAMP作为肾上腺素的第二信使被发现的工作，让另一位美国科学家 Earl Wilbur Sutherland 获得了1971年的诺贝尔奖，不过此时他已经辞世。

　　EDRF和NO的化学性质十分相似，例如EDRF性质不稳定，半衰期约是3-5秒，可以被超氧阴离子灭活，超氧化物歧化酶能使EDRF的半衰期延长到30 秒。和血红蛋白(Hb)相互作用前，Hb的最大吸收峰在433nm， EDRF和血红蛋白(Hb)相互作用后， Hb的最大吸收峰移动到406nm。NO和Hb反应时也同样具有上述变化。Ignarro成了故事的男二号。

　　说者无意听者有心!台下有一位观众叫Salvador Moncada，来自英国。他的研究领域是阿司匹林和前列腺素等方面，此前他也曾猜测EDRF会不会是一种新型的前列腺素。现在他知道怎么做了，会议还没结束他就匆匆忙忙回到了英国，他要精确的证明EDRF就是NO，而不只是猜测!很快，他的团队做到了。他的精妙实验结果刊在了次年的Nature上。

　　具体说来，Moncada的实验是这样设计的。他把培养的血管内皮细胞吸附在微载体上，装柱后用缓冲液洗脱;洗脱液以不同时间间隔作用去除了内皮细胞的主动脉血管条以检测EDRF的生物活性(看血管条是否舒张)，同时用化学发光法检测流出液NO的含量。并且把流出液与硝酸甘油的药理作用定量对比。结果发现，由缓激肽(BK)诱导内皮细胞释放的EDRF，不仅与NO在生物活性、半衰期等生物学特征上完全一致，而且可以被同样的药物阻断剂或激动剂抑制或增强!

　　非常完美的实验!随后，Ignarro也在PNAS上证明了EDRF就是NO，并且它还可以使cGMP升高。看起来，Ignarro好像晚了一步。

　　其实这时不应该忘记我们的男三号，Ferid Murad 。他是一位临床药理学家，大部分时间研究硝酸甘油的药理作用。他发现叠氮类化合物和硝酸甘油类药物能使血管平滑肌的cGMP大量生成，直接NO气体灌入作用效果类似，而cGMP是由鸟甘酸环化酶(GC)催化产生，如果事前抑制住GC，NO即使升高了，cGMP也不会增多。所以，整个故事就明白了。如图3所示。

　　

　　图3

　　乙酰胆碱激活了内皮细胞表面的受体，通过一系列的信号传递，激活了产生NO的酶，NO生成后扩散穿越到下层的血管平滑肌细胞，激活了鸟甘酸环化酶，使得cGMP大量增加，最后通过信号传递产生舒张血管的效应。

　　随后，产生NO的酶也被发现了，主要贡献者是David Bredt 。不同领域的科学家还发现NO有别的功能。Michael Marletta 发现巨噬细胞释放NO，帮助巨噬细胞消灭病原体。John Hibbs发现巨噬细胞释放NO的前体物质是L-精氨酸。John Garthwaite 发现谷氨酸能刺激神经细胞释放NO ，似乎NO还参与神经信号传递 。David Bredt 再接再厉发现大脑里有一种特殊型号的NO合酶，即nNOS 。巨噬细胞里的NO合酶比较特殊，正常情况下很少，需要“战斗”时会增多，就是iNOS，发现者是陈丰原教授的同事，匹兹堡大学的Timothy R. Billiar 教授。

　　总之，NO越来越热。1992年，NO被Science评选为“年度分子”，并以“No News is Good News”为专题发表了专论，高度评价了NO的发现和伟大意义。终于，在诺贝尔去世100年后的1998年，诺贝尔奖殊荣给了“NO”。获奖者就是Furchgott、Ignarro和Murad 。消息一公布，英国人觉得很不公平，因为他们的英雄Moncada才是真正第一个证明EDRF身份的人，为此还写信给诺贝尔奖评委会，不过评委会给出的意见是：诺奖只能授予三个人，如果可以授给四个人，我们会考虑Moncada 。不过怎么说，上帝总归是公平的。试想想，如果Moncada不去参加那次会议，他还会改变自己的研究方向吗?从竞赛上说，的确是Moncada率先完成了任务。可是科学就是如此，提出想法的人总会得到优先尊重!

　　当然事情到这里还没有完。药物开发商辉瑞公司看到了其中的机会。硝酸甘油虽然继续畅销。但是它的药效时间很短，作为心绞痛的急救药还行，但是很难作为抗高血压的药物。辉瑞想从NO的道路里挖点“降压药”卖。很快他们把目标锁定在了cGMP身上。cGMP的半衰期很短，因为一个叫磷酸酯酶的蛋白会把它很快降解掉，这也是为了维持机体的平衡，持续的血管舒展会导致血压过低引发休克，人就挂了。当然如果是高血压病人，那就刚好合适。辉瑞针对磷酸酯酶开始漫长了开发流程。苦心人天不负，有一个化合物终于熬到了临床试验。不过，坏消息接踵而至。这个化合物的药效很差，在高血压病人身上几乎看不到什么降压效果，尽管还比较安全。

　　正在辉瑞绝望的时候，眼看数十亿美金的投入即将毁于一旦。然而柳暗花明又一村，好消息来了。一组身患糖尿病的40、50岁的男性病人很喜欢吃这个化合物，还主动问试验医生索要，尽管他们的高血压病没有什么改善。细致的调查员发现了其中的原因。这群病人常年阳痿，吃了这个化合物可以让他们“重振雄风”。食色性嘛，人之常情，难怪这群人很喜欢这个化合物。

　　辉瑞觉得这是个起死回生的机会，立刻改变药物的研发方向，把这个化合物做成“壮阳药”。这个决定也保证了辉瑞直至今天的辉煌。不多久，一个别名叫“伟哥(Viagra)”药物开始畅销全球。有了全球男人的“欲望”作保障，“伟哥”简直成了辉瑞的印钞机，销售额股票双双看涨!

　　原来，男性阴茎海绵体的磷酸酯酶是另一种型号，不同于别处。伟哥是这个型号磷酸酯酶选择性的抑制剂，cGMP在伟哥的干扰下，在阴茎海绵体积聚发挥舒张血管的效应，于是海绵体开始充血膨胀——坚挺。由于伟哥跟其他位置的磷酸酯酶结合得并不紧，所以对全身血压反而没有什么影响。天意如此，情何以堪!

　　当然，NO的故事远不止这些。后来发现，硝酸甘油在体内能变成NO，是由一个叫乙醛脱氢酶的蛋白催化的，即ALDH2. 而这个ALDH2本来是催化酒精代谢，让酒精的中间毒性产物乙醛变成无毒的乙酸。ALDH2有个突变位点，导致酶活力很差，所以ALDH2正常的人能喝酒，适量的酒精对身体的伤害不大。但是对于有突变的人，酒精简直就是毒品，大量的乙醛会阴魂不散。这种情况在中国人中还特别普遍。ALDH2的突变对于硝酸甘油的药效也同样适用。这也是临床医生常苦恼的问题，为什么硝酸甘油有的人用起来给力，有些人则不行呢。几年前，复旦的金力教授和卢大儒教授领衔的课题组，在中国人群中做了硝酸甘油药效与ALDH2基因型的关系，结果发在了《临床调查》(JCI)上。

　　与NO一同起步的血管内皮领域也搞得红红火火，甚至衍生出《内皮生物学》的分支。其中，日本的科学家做出了很大的贡献。他们发现了内皮素等多个血管内皮相关的因子。在上世纪90年代初期，还发现了血管内皮的修复干细胞——内皮祖细胞(EPC)，这也是我现在博士期间的研究内容之一。

　　血管内皮细胞还分泌生长因子调节血管的生成，在癌症中很关键，正好硕士期间做过一点这方面的工作。肿瘤与血管新生又有另外一些故事，涉及到新的畅销药，我们改天再说吧!

　　参考资料：

　　1.唐小卿 PPT，http://www.docin.com/p-43707961.html

　　2.1998年诺贝尔医学或生理学奖.ppt

　　3.Robert F. Furchgott__The obligatory role of endothelial cells in the relaxation .pdf

　　4.Furchgott__ PNAS_Role of endothelial cells in relaxation of isolated arteries by.pdf

　　5.JPET__Association Between Cylic GMP Accumulation and Acetylcholine-Elicited Rela.pdf

　　6.Moncada__Nitric oxide release accounts for the biological activity of endotheliu.pdf

　　7.Moncada__Pharmacological Reviews__Nitric Oxide_Physiology , Pathophysiology , an.pdf

　　8.PNAS-1987-Ignarro-9265-9.pdf

　　9.Natue__Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochr.pdf

　　10.PNAS-1993-Geller-iNOS_Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide.pdf

　　11.http://www.mirm.pitt.edu/people/bios/Billiar1.asp#

　　12.PNAS-1990-Bredt-Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulin-requiring enzyme.pdf

　　13.http://en.wikipedia.org/wiki/Robert_F._Furchgott

　　14.JCI__ (ALDH2) Glu504Lys polymorphism contributes to the variation in efficacy of sublingual nitroglycerin.pdf