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乱花渐欲迷人眼—PCR扩增仪的选择

上一篇 / 下一篇  2011-02-23 10:45:08

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  1971 年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法,1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和 Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文,Mullis当时服务于Perkin Elmer(PE)公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.(ABI)公司收购、分拆、再转卖,而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今,PCR方法愈发趋向自动化,并从中衍生出更多的新技术方法,可以说,PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场,多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR的专利目前依然掌握在ABI和Roche(罗氏)两大公司手中,去年业界颇为引人瞩目ABI诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。

  PCR原理

  DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA 聚合酶的作用下,以单链为模版,根据碱基互补配对原则复制成新的单链,与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物,加入DNA聚合酶、 dNTP就可以完成特定基因的体外复制,多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。

  发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。

  从PCR原理可以看出,PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进,今天的PCR已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要,各厂家的PCR仪型号不同,着力宣传的技术指标和参数也不尽统一,生物通的编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标,希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。

  PCR仪介绍及其选购

  PCR仪的种类总体来说可以分为两大类:PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪,普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量PCR仪,此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR仪,生物通将在随后为大家介绍。

  一、温度控制

  对普通PCR仪来说,温度控制指标主要是指温度的准确性、均匀性、以及升降温速度,对梯度PCR仪来说,除了温度的准确性和均匀性、升降温速度以外,还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。

  温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性,它直接关系到实验的成败。如果排除样品加入过程中的问题,对于PCR反应而言最重要的莫过于温度控制的准确性,由于PCR是一个几何级数扩增的过程,扩增过程中退火温度的细微变化会被放大而直接影响结果,不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度,对退火温度而言温控显的尤为重要,有时1度甚至0.5度的差异也能决定实验的成功与失败,所谓差之毫厘,谬之千里。因而对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。

  温度的均匀性是指样品孔间的温度差异,它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。我们在实验中发现有时用同样的样品,同样的PCR反应程序,最后的结果竟然差异非常明显,或许就是因为不同位置的温度不均一性所致。一些使用过早期PCR仪的脑子格外灵光的研究人员偏爱使用PCR仪中间某几个固定的孔,就是因为过往反复的教训和认真的思索得出了这样的结论,PCR仪的温度均匀性不好,特别是最外周的样品孔情况更差,很有可能影响实验结果——即“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。正是这种位置效应对定量PCR的结果的影响更为明显,所以后来才有Roche和 Cobbett的离心式定量PCR的重大创新。

  温度控制除了精确度,还有一个厂家喜欢大力宣传的指标——升降温的速度。更快的升降温速度,可以缩短反应进行的时间,而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间,能提高PCR反应煌特异性。因此从本质而言温控方式就从以前相对稳定耐用的机械式转向了升降温更快速的半导体。除了机械本身的原因,影响升降温速度的还有制作承托样品管的基座模块的材料的导热性。例如ABI早就有升降温速度高达5°C的黄金基座(不要误会,是银质镀金而已,要是足金在哪儿可都长久不了),最近eppendorf也推出了升降温速度可达到6℃/秒和4.5/秒的银质模块,是目前同类产品中升降温速度最快的,据厂家资料,一个在其他仪器上原本需要需要40—60分钟的PCR反应,eppendorf Mastercycler ep(银质模块)只需运行28分钟——别小看这节约下来的几十分钟,一天下来就可以多运行好几轮了。而真正常用而经济的材料是铝合金。

  作为用户来说,当然更愿意选择升降温速度快的,这就像汽车上好看的表面配置一样容易看到,而内在的稳定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必须注意到,仪器的升降温速度和样品管中的样品的升降温速度并非同一回事,因为样品管与基座接触的紧密性、导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。

  现在的PCR仪如 ABI,Eppendorf的一般具有两种温控模式,即模块温控模式(Block-control)和反应管温控模式)(tube-control)。在模块温控模式下,机器根据探se器直接探se的温控模块(即承载样品的金属台)的温度进行控制,这种模式适用于长时间的静态孵育(如连接、酶切、去磷酸化等)。反应管温控模式实际上是一种模拟试管/PCR板的温控模式,根据探se器所探测到的温控模块的温度由计算机计算出管内/PCR板孔内样品液的温度来进行控制。一般说来,试管温控更为准确,因为管内样品的温度无法与温控模块同时达到预设温度。特别是PCR反应中的孵育过程一般都很短暂(30秒或更短),如果采用只有模块温控模式的话,反应混合物孵育的时间与程序设定的时间会有相当大的差距。而反应管控制精确的算法能自动补偿时间,而且适合各种类型的反应管,确保反应混俣物按照程序设定的时间维持预设温度。这里要表扬的是ABI——因为他们的宣传资料很老实的指出,模块升降温速度高达3.5℃,样品的实际平均升降温度是1℃左右,而且ABI的PCR仪中显示的温度也是计算出来的样品温度而非温控模块的温度。我们看到过有的品牌代理做的宣传资料中故意引用ABI的“样品实际平均升降温速度”去和自己的模块升温速度比较,未免有失公允。

  有的PCR仪厂家推出了另一种温控方式;热敏电极温控模式。该方法将一个热敏电极插入一个专门的测量管中(管中装有矿物油),反应进行时,将该测量管插入温控模块的样品进行检测。他们认为通过此途径可以监测反应管内样品的实际温度,但这种方法未免有些华而不实;(1)测量管中矿物油的温度变化与实际反应样品的温度变化未必一致;(2)因为测量管必须占用一个样品孔,所以使用该温控方式时就无法使用96孔PCR板作实验。

  梯度PCR

  对于一个PCR反应,虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算最适的退火温度,可是由于模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不一定能"P"出来结果,细微的变化对结果都可能产生决定性的影响,因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化,根据结果,一步就可以摸索出最适合的反应条件。不单退火温度,连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要,因为Taq和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异,优化延伸温度就显得很重要。多次实验可在一台仪器上完成,既节省实验时间提高效率,又节省实验成本。

  对于带梯度功能的PCR仪,需要考虑梯度模式下不同梯度管排间的温度均匀性和准确性,还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。这种差异可能导致在梯度模式下得出的最佳条件与标准模式下单独做的结果出现差异。SteadySlope技术是 eppendorf拥有的梯度PCR技术专利,可以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度,所以在梯度模式下具有恒定的温度性。这一技术保证了在梯度模式和普通模式之间可以进行可靠的信息传递,不会因为温度特性不同而导致产量和特异性的变化。MJ公司没有付专利费而选择在梯度模式下采用不同的降温速率,每个梯度温度之间的温度曲线不同,从梯度模式向普通模式进行转换的可能会出现问题。此外采用TCT(三组回路)技术的梯度PCR仪由于在梯度PCR模式下增加了一个加热和冷却的控制区域,保证了梯度温度控制的精确性并使不同梯度管排间的温度均匀性更好。

  在PCR仪上增加原位PCR模块就可以在玻片上进行原位PCR扩增,MJ和eppendorf的PCR仪都有提供原位适配器以满足不同需要。购买配有支持原位PCR模块的PCR仪对从事医学研究的工作者是很值得的,一机两用。

  此外,随着基因组高通量研究的需求的提高,各品牌都推出了多槽式高通量PCR仪,各有特长:MJ有一种一拖四,就是1个主机带4个扩增槽,每个槽可以独立控温,一次可以作96x4个样品的PCR,不过一旦出现问题4个都不能用了。ABI则在原来的9700的基础上推出了双384孔的基座,一次完成384x2个样品,使得9700的功能又扩展到高通量领域而无需购买新的机器,可惜两个384槽不能独立控温。 eppendorf则有一个控制面板,可以控制5个独立的PCR仪,每台机器可以联合,而且互不影响,但是比较浪费空间。

  二、仪器的功能性和人性化设计

  当然是越简单方便的设计最符合用户的要求。

  热盖——现在的PCR仪一般均配备热盖,热盖温度设为105℃,使样品管顶部的温度达到105℃左右,蒸发的反应液就不会产生凝集在管盖上而改变反应体积,这样用户就无需再向反应管内加石蜡油,直接减少后继反应的麻烦。如果是旋转加压的热盖就要特别小心,因为压力到达时没有明显的提示,用户需要根据经验将热盖旋到合适位置,不太容易掌握。如果过松,热盖没有充分接触反应管而影响结果;如果过紧,则会导致反应管变形,甚至可能造成热盖的机械故障。最新的ESP技术是指热盖加热时不接触样品管,避免加热样品管导致非特异产物,等加热到设定温度后热盖下降,将样品管压入加热模块,下降时间和压力都由电子控制。

  样品基座——PCR反应多在0.2或者0.5的管子中进行,多数PCR仪也配备了不同的可更换样品槽适配不同的样品管。eppendorf有一个有趣的设计,一个槽内带有0.2和0.5两种不同样品孔,不需更换基座就可以分别使用两种不同的反应管,或者96孔板,加原位适配器就可以变成原位PCR了。避免了换基座的麻烦。当然不同的反应管不可以同时使用的,因为高度不同,热盖不能作用。ABI的9700就可以更换不同的样品槽,样品槽系列扩增到从0.5到标准96孔,到双384孔板,分别适合不同的需要,相当灵活。

  软件——新的PCR仪都比较注重程序编写的简易性。大屏幕,显示实时信息,倒计时,记忆存储多个程序、自动断电保护等都有助于实验室中的复杂环境使用。程序储存方面,有人觉得储存程序的多少似乎意义不太大,但是对于实验人员多、PCR仪每天运作频繁的实验室来说,每个使用者独立储存自定义的PCR程序,确实能方便下一次的调用,会节约一些时间。

  综合考虑,一台PCR仪选购的关键还是在于用户自己的要求,有些功能可能都用不上或很少用,用户需要仔细斟酌,毕竟是一分钱一分货。

  在这里主要介绍的都是PCR领域的3大品牌,国内虽然有一些仪器厂家,甚至也有OEM,却还没有世界知名的国产品牌,原因在哪里?Made in China的家电已经进入世界的舞台,什么时候国产仪器才能进入世界各地的实验室呢?也许,经过思考的沉淀,不再浮躁,会有人创出一条路来。毕竟,有志者,事竟成。


TAG: pcr扩增仪

 

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